本发明专利技术涉及一种产生β-紫罗酮香气物质的枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因及应用。它具有SEQ ID No.1序列所示的核苷酸序列；通过提取新鲜枸杞叶片总RNA，通过同源克隆的策略和3'RACE技术克隆枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmCCD1，得到完整的编码基因序列为1641bp。构建了大肠杆菌表达载体pGEX-4T-1-LmCCD1，应用大肠杆菌异源表达系统，对克隆的枸杞细胞质抗坏血酸过氧化物酶基因LmCCD1编码的酶活性进行了鉴定。同时构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmCCD1，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，用于后续的转基因研究。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种報杞（/j.扣械？ 化化化>Miller)类胡萝h素裂解双加氧酶 (carotenoidcleavagedio巧genaseenzyme)的克隆，具体为--种能够产生β-紫罗酬等 香气物质的詢杞类胡萝l·素裂解双加氧酶化/)基因的克隆及应用。
技术介绍
_geret3.1.，2006)，这说明CCDs催化类 胡萝h素裂解是一个加双氧的反应，CCDs是--类具有双加氧特性的类胡萝h素氧化酶。 Schwartz等（200。实验表明，拟南芥Ate邸1巧裂解叶黄素生成目-紫罗酬，裂解β-胡萝h素生成β-紫罗厕巧CH的二醒（4，9-二甲基卡二烧-2,4，6，8，10-戊 婦--1，12-酵），并使玉米黄质转化为3-径基-β-紫罗酬和3-趋:基-α-紫罗刚司。 AtCCDl还可使全反式紫黄质转健为5，6-环氧--3-経基-β-紫罗鋼，裂解9-顺式…紫 黄质的末端的9'，10'顺式双键而生成C27的环氧-脱辅基类胡萝?、醒，使9-顺式…新 黄质裂解生成C巧的环氧-脱賴基类胡萝h醋巧C27丙二婦脱賴基类胡萝h醋，巧7化合 物则进一步裂解为C14二^隣和C13的酬（Andrewetal.，2004)。 拟畜芥化口i缺陷型突变体种子中类胡萝h素的含量增加，表明化巧/在类胡萝!、素健 化裂解过程中起作用（Auldirigeetal.，2006)。肖前化巧/同源基因已经在番茄（Andei相 etal,，2004).，牵牛花（Andrewetal.，2004)、香風（Mwafaqetal.，20日巧等多种 植物中被分离纯化。研究表明，植物类胡萝l·素裂解双加氧酶UCarotenoidCleavage Wo巧genasel，CCDl)在9，10和9'，10'巧键位置裂解线型和环聖的类胡萝h素而产生 多种天然活性化合物--脱辅基类胡萝l·素（apocarotenoids)，其中包括一些色素、芳香 物质、尘长调节剂和防御化合物等。而的催化活性需耍化2作为賴因子，它们含有与铁 结合的4个组氨酸（Schwartzetal.，1997)。而来源不同植物的CCD1酶的活性有所不同， 来自甜風的化巧/基因可W裂解全反式八氨番茄红素（phytoene)、番茄红素(:lycopene)、 β-胡萝l· 素（目-carotene)和δ-胡萝_3产物3…趋基…β…紫罗酬。Vogel(2008) 报道指出，拟南芥、玉米和番茄中的CCD1酶还具有新的裂解位置，即在日，6和(或）5'，6'位 置裂解番茄红素，产生芳香物质6-甲基-5…庚婦-2…關。最近的研究还表明，异源表达水 稻化巧/基因商臥在巧和C8位置降解单环或无环的类胡萝h素，产生香叶酸（UgetaL 2009)ο 在离体条件下，葡萄仿泌基因运能够裂解玉米黄质巧叶黄素，产生芳香物质3-姪 基…β---紫罗爾和C14 二醋（MathieuetaL2005，2007XLa.shbrooke(2010)化实葡 萄α化/基因可W裂解叠茄纽素和目--胡萝h素，产生假紫罗鋼和目--紫罗剛。目前已知撞 物化酶的属物较多，在离体条钟下，能够分别臥八氨番茄红素、番茄红素、目-胡萝!、素、 α-胡萝l·素、玉米黄质、紫黄质和新黄质等多种类胡萝l·素为反应底物，生成β-紫罗酬、 3-哲基…Ρ…紫罗丽、3-径基…幻…紫罗酬、香叶基丙酬、假紫罗刚罔、C27的环氧…脱辅基类 葫萝l·膳和C巧丙胃r:歸脫辅基类葫萝h膳等物质。而这些脱辅基类胡萝l·素参与了色素、 风味、香气的形成。水果中含有少量的揽辅基类胡萝h素，对人类健康却具有重耍意义。 脱賴基类胡萝?、素是矮牵牛（化姑·?ia如AricfeVilm)、番茄、胡萝h(化!化?化asro切 和杨桃（祐反化义?'3/此紛）香气物质重要的组成成分（Mwaiaqet-,3.1.，2006)。 β…紫罗鋼作为花的香气物质，能够剌激昆虫取食或起到昆虫性信息素的作用，因此是很好 的引诱满，引诱昆虫前来取食或"交尾"。而类胡萝?、素巧累使花呈现亮黄色、楼色或红色， 或吸引昆虫从而实现授粉。两者为植物种群稳定的繁衍提供了保韓。Lewin-sohn等（200巧 证明，西化（仿邸ar山巧?_/化:设3)和番茄中的类胡萝h素和稚类等挥发性物质在结构上是非 常相似的，类胡萝!、素的着色形式影鹏番茄和西風脱辅基类胡萝h素和阜祗芳香性挥发性 物质的组成形式。 WeiShu等（2010报到，在拟南芥中过表达/??仿巧i基因，可增加拟南芥花中目-紫 罗剛的禪放，并减轻十字花科跳甲的危害。而基因能提高多种植物及一些植物产品例 如葡萄酒、果汁等的风味，已在多种文献中有所摄道。直于化巧/基因能改良植物风味、参 与植物生长发育及抵抗非生物胁迫等重耍作用，因此已成为当今植物改良研究中的一个热 点。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种能够产生香嗦物质的构杞类胡萝h素裂解双加氧酶 基因。 本专利技术的第_r:个目的是提供该基因编码的蛋白质。 本专利技术的目的还在平提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。 本专利技术的另一个目的在于提供该基因的用途。 本专利技术提供了一种构杞类胡萝h素裂解双加氧酶基因胃心化巧/，如序列表中沈QID N化1所示的核昔酸序列构成。 本专利技术提供了一种上述构杞类胡萝?、素裂解双加氧酶基因心?化巧i编码的蛋白 质，勿j序列表中沈Qi!)N化2,胡-:不的氨基酸序列的蛋曰质。 本专利技术提供了一种上述掏杞类胡萝h素裂解双加氧酶基因优化/重组克隆载体 pMD18-T-心?化巧_/。 贿1引本专利技术提供了一种上述拘杞类胡萝h素裂解双加氧酶基因/.苗优猫重组植物表达 载体PCAMBIA2300--Z放仿巧/。 含有上述的构杞类胡萝h素裂解巧加氧酶基因心?优双/的重姐载体，该些重鍵载 体包括质粒。 所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pGEX-4T-i-红約I?i。 所述的质粒表达载体双元植物表达载体PCAMBIA2300-Z.掛仿化/。 含有i：述掏杞类葫萝h素裂解双加氧酶基因心約双/完整编妈阅读框序列的宿主 细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本专利技术的保护范围。 所述的畜主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或烟草缠胞。 本专利技术提供Γ一种含有心基因工程菌。i：述掏杞类胡萝h素裂解巧加氧酶基因化/的应羯包括该心?化巧堪因编妈的 蛋白在大肠軒菌和檀物中的应用；用所述的重纽载体，如植物表达载体转化玉米细胞；或 者用所述含有该基因的农杆菌与玉米、大豆、向日葵、马铃馨、棉花、谷子、大麦W及花弁和 蔬菓等细胞共培养，得到转基因的再生植株；或者巧所述的Zwa?/遗传转化获得上述物种 转基因植株。 本专利技术提供的一种掏杞类胡萝?、素裂解巧加氧酶基因Z.(紛?Λ如序列表中SEQID NO,i所示的核昔酸序列，还包括所示的核昔酸序列添加、取代、插入或缺失一个或多个核昔 酸的70%劲上同源序列或者其等位基因及其衍生的核昔酸序列。 本专利技术提供的--种构杞类胡萝l·素裂解双加氧酶基因心？化巧/编码的蛋白，如序 列衷据QIDNO。2所示氨基酸序列。本专利技术的克隆方法由下述步骤细成； 从靖杞叶片中提取总RNA，根据转录组化igene序列中构杞类胡萝h素裂解双加氧酶 基因Z逊优化/的核巧酸序列分强从5'端引物优化/--本文档来自技高网...
【技术保护点】
一个枸杞类胡萝卜素裂解双加氧酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：季静，王罡，金超，田小卫，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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