本发明专利技术涉及如SEQ ID NO.3的编码寄生疫霉ω-3脱饱和酶的重组核酸序列、含所述ω-3脱饱和酶的载体、含有所述载体的重组微生物特别是重组酿酒酵母菌，还涉及重组酿酒酵母菌的构建方法，以及所述含有所述脱饱和酶的酿酒酵母在多不饱和脂肪酸生物合成中的用途，其在常温下能够将C20:4Δ5,8,11,14催化为C20:5Δ5,8,11,14,17，催化效率达到65％。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种来源于寄生疫霉的ω-3脱饱和酶、含所述脱饱和酶的 载体、重组微生物及其应用
本专利技术属于生物工程
，设及利用微生物合成多不饱和脂肪酸，具体设及 一种用于合成多不饱和脂肪酸的ω-3脱饱和酶、含所述ω-3脱饱和酶的载体、含有所述载 体的重组微生物及其应用。 【
技术介绍
】 长链多不饱和脂肪酸化C-PUFAs)是指含有20个或20个W上碳原子的多不饱和 脂肪酸，按照第一个双键距离C端的位置可W分为ω-6和ω-3两类。c〇-3LC-PUFAs在人体 内无法自行合成，需要从饮食中获取，属于必需脂肪酸，如EPA和DHA。研究发现，WEPA和 DHA为代表的w-3LC-PUFAs可W作为合成某些激素的前体物质，具有多重生理功能和潜在 的药用价值。迄今为止，w-3LC-PUFAs的来源W深海鱼类为主，然而从中提取的LC-PUFAs 却存在稳定性差、纯化工艺复杂、易氧化等缺点。近年来，微生物作为一种新的LC-PUFAs 来源正受到越来越广泛的关注：海洋藻类通过自养、异养和混合营养的方式生长，生长周期 短，是EPA和DHA的初级生产者，也是w-3LC-PUFAs最有潜力的来源之一；酵母菌、霉菌等 研究成本低、适合大规模生产且遗传背景明细，拥有生产多种LC-PUFAs的潜力。随着分子 生物学和生物技术的飞速发展，人们将越来越多的目光投向了产油真菌，W期通过基因工 程改造菌体脂肪酸合成路径来生产EPA、DHA，但由于效率低下等原因，至今仍未实现商业 化。 自然界中w-3LC-PUFAs通常由LA和ALA起始合成，经过一系列去饱和酶和延长 酶催化，最终形成EPA和DHA。其中，ω-3脱饱和酶是q-3LC-PUFAs合成过程中的关键酶之 一，具有Ξ个富含组氨酸的结构域，能将ω-6多不饱和脂肪酸如LA(C18:2)、GLA(C18:3)、 DGLA(C20:3)和ARA(C20:4)分别催化生成对应的ω-3多不饱和脂肪酸ALA(C18:3)、 SDA(C18:4)、ETA(C20:4)和EPA(C20:5)。 研究发现，不同来源的ω-3脱饱和酶对不同碳链长度的脂肪酸具有不同的催化 效率。目前，已知的来源于藻类和植物的ω-3脱饱和酶只能催化18C的ω-6多不饱和脂肪 酸如LA和GLA。而来源于秀丽隐杆线虫的ω-3脱饱和酶FAT1则能同时W18C和20C的 多不饱和脂肪酸为底物，但其中对20C底物的催化活性很低。随后，Pereira等人发现来源 于异枝水霉的ω-3脂肪酸脱饱和酶sddl7对18C的多不饱和脂肪酸没有催化活性，却能将 20C的ARA催化为EPA，转化率为25. 9%。同样的，来源于致病疫霉的ω-3脱饱和酶0PIN 17也不能W18C的多不饱和脂肪酸为底物，但是对ARA的转化率达到了 30. 94%。 阳0化]近年来，Xue等人从瓜果腐霉、大豆疫霉菌、栋树巧死病菌中分离出Ξ种ω-3脱饱 和酶--PaD17、PsD17和PrD17并在重组解脂酵母菌中实现异源表达（Identification andcharacterizationofnewΔ-ITfattyaciddesaturases,ApplMicrobiol Biotechnol(2013) 97:1973 - 1985)。这S种酶既能催化18C又能催化20C的多不饱和脂肪 酸，但偏好催化20C底物ARA。通过对运些偏好催化20C脱饱和酶的进一步研究发现，其在常 溫下对ARA有较高的转化率，实现了常溫下生物积累EPA。运一类偏好W20Cω-6LC-PUFAS为底物催化合成ω-3LC-PUFAS的脱饱和酶可W直接、高效地催化ARA生成ΕΡΑ，为通过延长 酶催化合成DHA提供了底物，对于生物合成法生产w-3LC-PUFAs具有十分重要的意义。为 了提高生产效率，筛选此种高效催化ARA合成EPA的脱饱和酶显得尤为重要。运将为构建 高产ω-3LC-PUFAS的工程菌，常溫发酵生产EPA、DHA，打下坚实的基础。 【
技术实现思路
】 本专利技术的目的是利用生物信息学的方法，获得一些常溫偏好20C的ω-3脱饱和 酶，通过构建重组工程菌，对每一种ω-3脱饱和酶催化ARA生成ΕΡΑ的能力进行了鉴定，W 获得最具有重要应用潜力的高效催化20Cw-6LC-PUFAs合成w-3LC-PUFAs的脱饱和酶。 本专利技术的思路是将5种已知的常溫偏好20C的ω-3脱饱和酶序列进行比对，根据 序列相似度及同源性分析，筛选出与已知序列相似度高、亲缘性近的来自寄生疫霉的基因 序列如沈QIDNO. 1和来自真菌媒介丝囊菌的基因序列沈QIDNO. 5。利用ClustalW2软 件将其氨基酸序列与多种已知的常溫偏好20C的ω-3脱饱和酶序列进行比对，发现天然的 来自寄生疫霉的基因序列如SEQIDNO. 1和来自真菌媒介丝囊菌的基因序列SEQIDNO. 5 拥有与已知序列相似的3个化s-box区。通过ΤΜΗΜΜ软件分析结果显示所选序列具有与已 知序列相似的跨膜域，随后进行活性验证。[000引进一步，本专利技术利用全基因合成技术构建了两段经过优化的ω-3脱饱和酶序列： 如沈QIDNO. 3的oPpFADS17和如沈QIDNO. 7的oAiFADS17。使用PCR技术扩增出目的基 因片段，插入PYES2/NTC表达载体得到PYES2/NTC-0巧FADS17和PYES2/NTC-0AiFADS17 并完成测序验证，进而用化学法转化入酿酒酵母INVSc1，得到的重组工程菌株能顺利表达 两段基因编码的蛋白。最后通过外源添加不同碳链长度的多不饱和脂肪酸底物进行活性验 证，确定筛选的0PpFADS17、oAiFADS17序列具有ω-3脱饱和酶活性。 本专利技术提供具有特异性催化20C能力的ω-3脱饱和酶的编码序列，其核酸序列分 别如沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 7。 本专利技术还提供分别含有SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 7核酸序列的表达载体 PUC57-0巧FADS17和PU巧7-〇AiFADS17,能够分别表达寄生疫霉和真菌媒介丝囊菌的ω-3 脱饱和酶。 本专利技术还提供能够分别表达寄生疫霉和真菌媒介丝囊菌的ω-3脱饱和酶的重组 微生物。优选地，所述重组微生物是酿酒酵母。 本专利技术成功表达了来源于寄生疫霉和真菌媒介丝囊菌、在多不饱和脂肪酸生物 合成途径中起关键作用的ω-3脱饱和酶oPpFADS17和oAiFADS17,其氨基酸序列分别如SEQ IDNO. 4 和沈QIDNO.8。 本专利技术还设及上述ω-3脱饱和酶oPpFADS17和oAiFADSl?在多不饱和脂肪酸生 物合成中的用途，特别是在常溫下将C20:4&5's'ii'i4催化为C20:5 As's'ii'M'"。 本专利技术通过实验方法获得两种ω-3脱饱和酶既能催化18C又能催化20C的多不 饱和脂肪酸，但偏好于将20C的ARA转化为ΕΡΑ，，催化效率达到65%。用此基因构建基因 工程菌株为后续工业化生产ΕΡΑ、DHA奠定了应用基础。 【【附图说明】】[001引图1为PCR扩增的目的基因片段图； 其中Μ为核酸Marker;泳道1为oPaFADSl?基因片段（lOSObp);泳道2为 0巧FADS17基因片段（l〇86b本文档来自技高网...
【技术保护点】
如SEQ ID NO.3的编码寄生疫霉ω‑3脱饱和酶的重组核酸序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈海琴，陈永泉，陈卫，梅甜甜，顾震南，张灏，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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