本发明专利技术公开了一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。神经修复材料的原料是由骨髓基质干细胞、含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖液体培养基和含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠培养基组成，其制备方法是首先将骨髓基质干细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖液体培养基中培养得到培养物；然后将培养物置于含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠液体培养基中培养；得到神经修复材料。将神经修复材料注入患病受体内，从而促进消化道肠神经系统大量神经再生和胃肠动力的恢复。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及神经修复材料领域，具体地指一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经 系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。
技术介绍
肠神经系统（entericnervoussystem，ENS)是外周神经系统的一部分，它在消化 系统的多项基本生理功能，如胃肠道运动、消化吸收、分泌及血流中，发挥重要调控作用。特 别的，ENS对消化道功能的调节具有相对独立性，能在脱离中枢的条件下对器官实施局部整 合，因而也被称为"肠脑"。 多种因素，包括基因、药物（刺激性泻剂）、炎症以及年龄的老龄化等可引起ENS 的损伤，表现为神经变性、神经节细胞缺失；神经递质合成、含量、分泌异常及其受体系统表 达上调或下调最终导致胃肠道运动、感觉、分泌功能紊乱等。ENS功能的异常或退化可以引 起先天性肠神经系统动力障碍，如先天性巨结肠，同样亦能够引起多种后天消化道运动功 能障碍疾病，包括贲门失弛缓症、胃食管反流病、胃排空延迟、糖尿病胃轻瘫以及便秘等。这 类疾病发病率高，症状顽固，反复出现，严重影响病患的生活质量。由于胃肠道生理功能调 控的复杂性，肠神经系统损伤及退行性变引起的胃肠功能紊乱相关疾病目前尚缺乏有效的 治疗手段。 骨髓基质干细胞（Bonemarrowstromalcells,BMSC)是来源于中胚层具有自我 更新能力和多向分化潜能的成体干细胞。相较于其它干细胞，骨髓基质干细胞自身具有良 好的易获得、易分离、易扩增、易修饰、特别是免疫赦免的特性，而在基因工程领域受到关 注。比如，神经干细胞虽被报道对神经损伤具有一定的修复作用，但由于其难获得，移植排 斥反应导致移植细胞局部存活率低、移植后表达神经标记物的细胞是否真具有神经细胞的 功能、远期效果不确定等诸多问题尚有待解决。目前BMSC在ENS损伤修复中的作用尚未见 报道。不同的研究团队关于BMSC对中枢神经系统损伤修复效果及机制的研究结果也参差 不齐，各有争议。干细胞的干预条件不同是导致修复结果不同的重要原因。BMSC的多向潜 能性也就导致了其可塑性，如何选择最适合的预处理条件、修复条件将对于有效提高BMSC 神经损伤的修复效率有重要意义。目前对于BMSC在ENS损伤中最佳修复条件的探索尚未 见报道。
技术实现思路
本专利技术的目的针对ENS功能障碍相关疾病还没有形成有效治疗体系的缺陷，提供 了一种。 它将骨髓基质干细胞（Bonemarrowstromalcells,BMSC)和含有神经胶质细胞源性神经 营养因子（glialcellline-derivedneurotrophicfactor，GDNF)的胎肠培养基（fetal gutconditionmedium，FGCM)共同培养预处理，得到神经修复材料，并将神经修复材料注 入患病受体内，从而促进消化道肠神经系统大量神经再生和胃肠动力的恢复。 为实现上述目的，本专利技术提供的一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能 缺失或障碍的神经修复材料中的应用。 为实现上述应用过程，本专利技术还提供了一种用于治疗肠神经系统功能缺失或障 碍的神经修复材料，它的原料是由骨髓基质干细胞、含有碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblastgrowthfactor,BFGF)的DMEM低糖液体培养基和含有神经胶质细胞源性神 经营养因子的胎肠培养基组成，其中，所述DMEM低糖液体培养基的配方为1000mg/L的葡 萄糖，15 %的胎牛血清，2mmol/L的L-谷氨酰胺，110mg/L的丙酮酸钠，100U/ml青霉素和 100μg/ml链霉素； 所述胎肠培养基的制备方法，包括以下步骤： 1)取胚胎发育15天的SD孕鼠，45mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射常规麻醉大鼠； 2)无菌条件下取出8~10条胎肠，用无Ca2+，Mg2+的PBS清洗2~3次； 3)再用lmg/mL的胶原酶常温消化15min; 4)PBS洗2次，反复吹打研磨，加入含有20μg/mL纤连蛋白的DMEM低糖液体培养 基，并接种于培养瓶中； 5) 3天后收集培养液，84g离心5min，取上清过滤，即得到FGCM原培养基； 6)使用时，将FGCM原培养基与DMEM低糖液体培养基按体积比1 : 1混合，并调整 pH值为7. 4,即得到胎肠培养基。 作为优选方案，所述DMEM低糖液体培养基中碱性成纤维细胞生长因子的含量为 6~16ng/mL,最优选为：碱性成纤维细胞生长因子的含量为10ng/mL;胎肠培养基中神 经胶质细胞源性神经营养因子的含量为8~14ng/mL，最优选为：神经营养因子的含量为 10ng/mL〇 作为优选方案，所述骨髓基质干细胞含量是约1.OX106个/mL。 上述神经修复材料的制备方法，包括以下步骤： 1)首先将骨髓基质干细胞置于含有碱性成纤维细胞生长因子的DMEM低糖液体培 养基中，培养12~36h;得到培养物；最佳培养时间为24h; 2)将步骤1)得到培养物置于含有神经胶质细胞源性神经营养因子的胎肠培养基 中培养10~15d，最佳培养时间为10d，得到神经修复材料；其中，每3天更换培养基。 本专利技术的有益效果在于： 1)本专利技术的神经修复材料用于治疗肠神经系统功能缺失或障碍，该神经修复材料 是由骨髓基质干细胞（Bonemarrowstromalcells,BMSC)、含有碱性成纤维细胞生长因子 (basicfibroblastgrowthfactor，BFGF)的DMEM低糖液体培养基和含有神经胶质细胞源 性神经营养因子（⑶NF)的胎肠培养基（FGCM)共同培养预处理，得到神经修复材料注入患 病受体内，从而促进消化道肠神经系统大量神经再生和胃肠动力的恢复。说明经过预处理 的BMSC可以用于ENS功能缺失或障碍相关疾病的治疗。 2)本专利技术神经修复材料中共同培养（预处理）的BMSC可以导致有效神经再生，没 有经过培养预处理的BMSC没有发现有效神经再生现象。体内外实验表明BMSC可能通过影 响神经胶质细胞源性的神经营养因子正反馈机制促进神经再生。 3)本专利技术制备神经修复材料的方法提供了一种治疗胃肠道肠神经系统疾病的手 段，该方法可以有效地运用于其它神经损伤相关疾病修复的应用中。【附图说明】 图1为BMSC培养鉴定图 图lA(a~f)为BMSC培养图：a_c为第一代BMSC按时间培养（第1天、第3天， 第7天）的细胞观察图；d-f为第二代（P2)、第四代（P4)、第六代（P6)培养的细胞观察图； 图1B为BMSC流式鉴定图； 图1C为第六代（未处理）BMSC表面表达神经元细胞标记物的免疫荧光图，其中纵 坐标的中文含义为未处理的BMSC; 图2为BMSC分化为骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞的染色图图中，图A为脂肪细胞（Adipocytes)、 图B为骨细胞（Osteoblasts)、 图C为软骨细胞（Chondrocytes); 图3为经过预处理后的BMSC表现为神经元样细胞的免疫荧光图 其中，图A~C为经过神经修复材料处理后BMSC表面表达神经元细胞标记物 (PGP9. 5,NSE,Tujl,HuC/D，nNOS)的荧光图， 图D为对照组（未处理）BMSC表面表达神经元细胞标记物的荧光图， 图E-Ι表示为经神经修复材料处理后表面阳性表达神经细胞标记物BMSC的百本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种骨髓基质干细胞在制备治疗肠神经系统功能缺失或障碍的神经修复材料中的应用。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：侯晓华，李绪行，蔺蓉，
申请(专利权)人：华中科技大学同济医学院附属协和医院，
类型：发明
国别省市：湖北;42
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