本发明专利技术涉及医学检验技术领域，具体涉及一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒及其应用。所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液、DNA聚合酶和稀释液，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。本发明专利技术的试剂盒定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，检测速度快，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及医学检验
，具体设及一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒及 其应用。
技术介绍
沙雷菌是一种能引起沙雷菌肺炎和败血症的致病菌，在环境中广泛存在，主要为 医院内获得性感染，发病率明显增多，且耐药菌株增多，治疗困难。与一般急性细菌性肺炎 相似，主要表现为发热、寒战、咳嗽、咯血疲或假性血疲或黄疲、呼吸困难、胸痛。沙雷菌感染 已成为常见的、传播广泛的条件致病菌之一，但早期诊断困难，常常导致治疗时机延误，病 死率高。传统的分离、培养和病理鉴定等诊断方法敏感性低、阳性率低。早期、快速、简便、 敏感、特异的诊断方法是目前条件性沙雷菌感染实验诊断研究领域的热点。[000引巧光PCR技术在1995年由美国阳公司率先研制成功，它兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化。与普 通PCR相比，其结果可实时观察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了 污染。
技术实现思路
本专利技术需要解决的现有技术的问题是：沙雷菌感染早期诊断困难，现有技术的诊 断方法敏感性低、阳性率低，导致病情延误。 为了解决上述问题，本专利技术提供了一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，用来解 决现有的沙雷菌感染诊断困难，敏感性低、阳性率低的问题。 具体而言，本专利技术提供了一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包 括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液 中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。 优选的，所述特异性引物包括引物1和引物2,其中引物1的序列SQ1为： 5' -cacgccatcagatgtgcc-3'; 引物 2 的序列SQ2 为：5, -agtgtggctggtcatcctctc-3,。 优选的，所述特异性探针为带有巧光基团和泽灭基团的特异性序列，其中，所述的 巧光基团选自FAM、肥X、TET、VIC中的一种，优选为FAM、VIC;所述的泽灭基团选自MGB、 TAMRA、B册中的一种，优选为MGB。 优选的，所述的特异性探针的序列SQ3为：5' -ctcacctaggcgacgat-3'。 优选的，所述阳性标准品中含有插入了沙雷菌特异性DNA序列SQ4的重组质粒，其 中，SQ4的序列如下： cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg 60 ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag 120 曰c曰cggtcc曰 g曰ctcct曰eggg曰ggc曰gc曰 gtgggg曰曰t曰 ttgc曰c曰曰tgggege曰曰gee 180 优选的，所述重组质粒的浓度为1.OX1〇3~1. 0X107。 优选的，所述的阴性标准品包含有不含沙雷菌特异性DNA序列的质粒。 优选的，所述的质粒或重组质粒相同，选自祀了3、口11〔3、口61-1\地1?322、口10-1'中的 一种，优选为pGM-T、地R322。 优选的，所述的反应液还包括缓冲液和dNTPs。 优选的，所述的缓冲液包括Ξ径甲基氨基甲烧、氯化钟和氯化儀。 优选的，所述的Ξ径甲基氨基甲烧的浓度为50~200禮，优选为100~150mM;氯 化钟的浓度为300~800mM，优选为400~600mM;氯化儀的浓度为10~30mM，优选为10~ 20mM〇 优选的，所述的DNA聚合酶为化qDNA聚合酶。 本专利技术同时提供了引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列SQ3 用于制备沙雷菌含量测定用试剂中的应用。 优选的，所述的沙雷菌含量测定用试剂的使用方法如下： 取样本DNA加入到反应液中，作为样品检测组，然后分别在阳性标准品、阴性标准 品W及样品检测组中加入DNA聚合酶，混合均匀后进行巧光定量PCR反应，其中反应液、阳 性标准品、阴性标准品中均含有引物1的序列SQ1、引物2的序列SQ2和特异性探针的序列 SQ3。优选的，所述的巧光定量PCR反应条件为：94~95°C预变性2~5min，1个循环； 94~95°(：15~203、55~601：30~503,40~50个循环。 其中，所述的质粒可W为本领域常用的任何可插入外源基因的质粒，可W为常见 的祀Ts系列、pUCs系列、PBR322、pGM-T等，pUCs系列优选为PUC18、PUC19等。 其中，特异性引物与特异性探针根据沙雷菌高度保守序列特性设计，用于检测沙 雷菌。 而且，专利技术人创造性的选取了沙雷菌特异性DNA序列SQ4,将其与质粒载体连接的 重组质粒作为阳性标准品，其检测的特异性高，灵敏度高。 本专利技术的有益效果为： 1)本专利技术试剂盒定量准确，兼有PCR的高灵敏性、DNA杂交的特异性和光谱技术精 确定量的优点，结果直观，能直接检测PCR过程中的变化，与普通PCR相比，其结果可实时观 察，产物不需要凝胶电泳检测，完全闭管操作，有效地降低了污染。 2)本专利技术试剂盒检测灵敏度和特异性高，由于采取特异性引物和探针的双保险设 计，灵敏度和特异性均有很大提高，能在临床症状出现之前检测到沙雷菌的感染。 3)本专利技术试剂盒检测速度快，总共仅需2个小时，步骤简单，可同时进行高通量样 本检测。 下面结合附图和各个【具体实施方式】，对本专利技术及其有益技术效果进行详细说明， 其中：【附图说明】图1为实施例一的沙雷菌阳性标准品的巧光PCR扩增曲线和阴性标准品的巧光 PCR扩增曲线。[003引图2为实施例一的沙雷菌临床样本的巧光PCR扩增曲线。【具体实施方式】 如上所述，本专利技术提供了一种用于沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，其目的是为 了提高被测人群沙雷菌诊断的灵敏度和特异性，提供早期诊断的可靠性。 具体而言，本专利技术提供了一种沙雷菌定量检测巧光PCR试剂盒，所述的试剂盒包 括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液 中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。 其中，在本专利技术的一种优选实施方式中，所用到的特异性引物W及特异性探针的 DNA序列分别为：特异性引物1的序列SQ1为：5' -cacgccatcagatgtgcc-3'，作为正向引物；特异性引物2的序列SQ2为：5' -agtgtggctggtcatcctctc-3'，作为反向引物；特异性探针的序列SQ3 为：5' -ctcacctaggcgacgat-3'。 在所述阳性标准品中含有插入沙雷菌特异DNA序列SQ4的pGM-T载体质粒，所插 入序列SQ4如下：SQ4:cttcgggcctcacgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtggggtaatgg 60ctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactggaactgag 120 过c过cggtcc过 g过ctcct过eggg过ggc过gc过 gtgggg过过t过 ttgc过c过过tgggcgc过过gcc 180 在本专利技术的具体实施中，所述阳性工作标准品含有重组质粒的浓度为1. OX lO3~ 1.OXl〇7。 本专利技术中本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沙雷菌定量检测荧光PCR试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括阳性标准品、阴性标准品、反应液和DNA聚合酶，所述阳性标准品、阴性标准品和反应液中均含有用于沙雷菌检测的特异性引物和特异性探针。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘鹏飞，杨希寅，姬晓兵，韩雪，
申请(专利权)人：天津脉络生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
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