本发明专利技术公开了一种嵌合抗原受体及其基因和重组表达载体、工程化HER1靶向性的NKT细胞及其应用，所述嵌合抗原受体为HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由HER1ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。采用本发明专利技术的嵌合抗原受体HER1ScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞治疗进展期HER1阳性肺癌时，能够有效避免采用HER1酪氨酸激酶抑制剂时引起的耐药性，对肺癌细胞具有一定的特异杀伤活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于肿瘤生物制品领域，具体地，涉及过继免疫治疗中的一种嵌合抗原受 体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化肥R1祀向性的NKT细胞 (CARHER1-NKT细胞）及其应用。
技术介绍
EGFR(epithelialgrowthfactorreceptor,表皮生长因子受体）即肥R1,是原癌 基因c-erbBl的表达产物，属于人类表皮生长因子受体（肥时家族，其本身具有酪氨酶激酶 活性，一旦与表皮生长因子巧G巧组合可启动细胞核内的有关基因，从而促进细胞分裂增 殖。肥R1在多种恶性肿瘤中高表达，研究发现肥R1表达于大多数肺癌患者，表达水平达到 80%，其表达水平与肺癌疾病的进展及转移有关。尽管最近肺癌的治疗已经获得一定的进 展，但是仍然未提高患者的生存率，因此亟需探讨新的疗法来克服送一困扰。目前，在治疗进展期肥R1阳性肺癌患者时，肥R1酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinaseinhibitors,TKIs)已经处于临床研究阶段，但是，临床结果表明，仅部分肺癌患者 采用肥R1酪氨酸激酶抑制剂治疗有效，并且患者最终会产生一定的耐药性，从而影响药物 的疗效。
技术实现思路
本专利技术的目的是为了克服现有技术中采用肥R1酪氨酸激酶抑制剂治 疗进展期HER1阳性肺癌患者时引起的耐药性的缺陷，提供一种嵌合抗原受体 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ及其基因和重组表达载体、工程化肥R1祀向性的NKT细胞 (CAR肥R1-NKT细胞）及其应用，嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细胞 在治疗进展期肥R1阳性肺癌时，能够有效避免采用肥R1酪氨酸激酶抑制剂时引起的耐药 性，对肺癌细胞具有一定的特异祀向杀伤活性。 本专利技术的专利技术人在研究中意外发现，采用嵌合抗原受体 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细胞治疗进展期肥R1阳性肺癌时，能够有效避免采 用肥R1酪氨酸激酶抑制剂时引起的耐药性，对肺癌细胞具有一定的特异祀向杀伤活性。因此，为了实现上述目的，第一方面，本专利技术提供了一种嵌合抗原受体，所述嵌合 抗原受体为肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的较链区化inge区）和跨膜区、 CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。 第二方面，本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。 第Η方面，本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。 第四方面，本专利技术提供了一种工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ细胞，所述ΝΚΤ细胞是上 述嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细胞。 第五方面，本专利技术提供了上述工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ细胞在制备用于治疗肿瘤 的制剂中的应用。 在治疗进展期肥R1阳性肺癌时，本专利技术的嵌合抗原受体 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NKT细胞，即工程化肥R1祀向性的NKT细胞能够特异 性结合肥R1抗原，明显延长免疫细胞在患者体内的存活时间，增强免疫细胞祀向识别肺癌 细胞表面HER1抗原的能力，加强对肺癌细胞的特异杀伤活性，而且确实能够有效避免采用 肥R1酪氨酸激酶抑制剂时引起的耐药性。本专利技术的工程化肥R1祀向性的ΝΚΤ细胞为治疗 进展期肥R1阳性肺癌提供了一种新的选择，具有良好的产业应用前景。 本专利技术的其它特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予W详细说明。【附图说明】图1为流式细胞术对分离培养的ΝΚΤ细胞表型分析的结果。 图2为本专利技术的慢病毒表达载体PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切酶Mlul/ Sail双酶切片段的电泳鉴定图。[001引 图3为本专利技术的慢病毒表达载体pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的限制性内切 酶BamHI/Sall双酶切片段的电泳鉴定图。 图4为本专利技术的慢病毒表达载体pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的结构示意 图，其中，逆时针序列为正向基因片度，顺时针为反向基因片段。 图5为流式细胞术检测含有嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的病毒浓 缩液对ΝΚΤ细胞的感染效率。 图6为流式细胞术检测嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的ΝΚΤ细 胞（CARHER1-NKT细胞）表型鉴定的结果。 图7为本专利技术的CARHER1-NKT细胞对人肺癌细胞杀伤作用的细胞毒性分析图。 图8为本专利技术的CAR肥R1-NKT细胞对进展期肥R1阳性肺癌患者治疗过程中，患者 病灶部位肥R1阳性肺癌细胞数目的变化。[002。 图9为本专利技术的CAR肥R1-NKT细胞对进展期肥R1阳性肺癌患者治疗过程中，患者 病灶部位影像图变化。【具体实施方式】 W下对本专利技术的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本专利技术，并不用于限制本专利技术。 本专利技术提供了 一种嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体为 肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ，由肥RlScFv、CD8的较链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构 域和〔03ζ的胞内信号结构域串联构成。优选情况下，嵌合抗原受体的氨基酸序列如SEQ IDNO. 1 所示。 本专利技术提供了编码上述嵌合抗原受体的基因。优选情况下，编码上述嵌合抗原受 体的基因的核巧酸序列如SEQIDNO. 2所示。 本专利技术提供了含有上述基因的重组表达载体。优选情况下，重组表达载体为慢病 毒表达载体。对于慢病毒表达载体没有特别的限定，只要能够与辅助载体共转染包装细胞 如293T包装细胞，获得病毒浓缩液及嵌合抗原受体肥RlScFv-CD8-CD137-CD3ζ修饰的NTK 细胞即可，优选情况下，慢病毒表达载体为pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ。 对于慢病毒表达载体ρΚΡΤ-ΗΕΚ15οΡν-〔08-〔0137-〔03ζ的制备方法没有特 别的限定，可W为本领域技术人员能够想到的各种方法，优选情况下，慢病毒表达载体 pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3ζ的制备方法包括W下步骤： (1)从ΝΚΤ细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的胞 内信号结构域和〔03ζ的胞内信号结构域，并克隆至载体pWPT-GFP中，构建得到 PWPT-CD8-CD137-CD3ζ；[002引 似合成编码大鼠生长激素信号肤和肥RlScFv的核巧酸序 列，并克隆至PWPT-CD8-CD137-CD3 ζ中，经测序验证后得到序列正确的pWPT-HERlScFv-CD8-CD137-CD3 ζ。[002引步骤（1)中，对于从ΝΚΤ细胞cDNA中分别扩增CD8的hinge区和跨膜区、CD137的 胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域的方法没有特别的限定，可W为本领域常用的 各种方法，例如可W为RT-PCR法。其中，ΝΚΤ细胞可W通过分离人静脉血中的单个核细胞， 然后进行培养获得。 具体地，得到PWPT-CD8-CD137-CD3ζ的方法可W包括；提取ΝΚΤ细胞的总RNA， 逆转录获得ΝΚΤ细胞cDNA，W得到的ΝΚΤ细胞cDNA为模板，利用引物Ρ本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体为HER1ScFv‑CD8‑CD137‑CD3ζ，由HER1ScFv、CD8的铰链区和跨膜区、CD137的胞内信号结构域和CD3ζ的胞内信号结构域串联构成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：韩为东，韩庆旺，王晓慧，郭业磊，丰恺超，付小兵，
申请(专利权)人：西比曼生物科技上海有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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