多糖多酚植物基因组的提取方法技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，公开了一种多糖多酚植物基因组的提取方法，步骤为：取植物材料研磨后加入核酸分离缓冲液和2-巯基乙醇，混匀后置水浴中；离心机中离心后弃上清；加入1×PBS溶液，研磨仪上震荡混匀，离心后弃上清；向沉淀中加入预热的3×CTAB裂解液并混匀，水浴裂解；加等体积酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入等体积氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；取上清，加入NaCl和冰异丙醇，混匀，沉淀1～3小时；取出离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加TE溶解，即完成提取。本发明专利技术能有效去除多糖多酚，减少糖和酚类物质对核酸提取的影响，提高DNA的质量和浓度。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于分子生物学
，特别设及一种应用于植物基因组提取的方法。
技术介绍
阳〇〇引基因组DNA的提取技术是遗传学与分子生物学研究中的基本技术。DNA提取是分 子分析的重要步骤，在得到基于凝胶系统的高分辨率结果方面起着重要作用，高质量的DNA 是获得准确试验结果的基础。 现有多种DNA提取方法，如CTAB法、高盐低抑法、SDS法、苯酪法和提取试剂盒的 使用等。但是，对于多数叶厚汁多、含有大量多糖类和其他次生代谢产物的植物来说，采用 常规的方法很难提取出高质量的DNA，因而需要改良常规的分离方法。 CTAB是一种去污剂，可破碎细胞壁和细胞膜，并能与核酸形成复合物，在高盐溶液 中是可溶的，当降低溶液盐浓度到一定程度时，从溶液中沉淀，通过离屯、，可将CTAB--核酸 复合物同蛋白质、部分多糖类物质分开。溶解于高盐溶液中的CTAB--核酸复合物，加入乙 醇可使核酸沉淀，而CTAB则溶于乙醇。CTAB法是目前应用最广泛发展较成熟的方法，最大 优点就是除去多糖。在CTAB法的基础上进行适当的改良，获得了高质量的DNA分子。细菌 一般分为革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，革兰氏阳性菌和真菌的基因组提取一直困扰着科 研人员。目前提取微生物基因组的方法主要有酶解法、化学或者热裂解法、磁珠或超声波机 械破壁，又或者是上述几种方法的结合。但运些方法提取出的基因组浓度很低，且大多污染 严重，不能满足Ξ代测序的要求。
技术实现思路
阳0化]本专利技术的目的在于提供一种改进的多糖多酪植物DNA提取方法，从而对富含多糖 多酪植物材料的基因组实现快速高效的获取。 为解决上述技术问题，本专利技术的实施方式提供了一种多糖多酪植物基因组的提取 方法，包含下述步骤：（1)取待提取植物材料，研磨后加入核酸分离缓冲液和2-琉基乙醇， 并使所述2-琉基乙醇的终浓度为1 %~5 %，震荡混匀后，置于75~95度水浴中5~30分 钟；似从水浴中取出后，离屯、机中高速离心弃掉上清液；做加入1XPBS溶液，研磨仪上 震荡混匀，高速离屯、，弃上清；(4)向沉淀中加入500~lOOOul预热3XCTAB裂解液并混匀， 65度水浴裂解30~60分钟；(5)加等体积的酪/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离屯、；(6)取 上清，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀，离屯、；（7)取上清，加入化C1和冰异丙醇， 上下颠倒混匀，在-20~-80度环境下沉淀1~3小时；（8)取出，离屯、后，将沉淀用乙醇洗 涂，风干后加TE溶解，即得到所提取的基因组。 本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提取方法，其创新点在于：一 方面，在核酸分离缓冲液中适当提高2-琉基乙醇的浓度，能有效的去除多酪W及代谢物 质，能降低后续裂解多酪物质多提取的影响；另一方面，使用IxPBS缓冲液清洗并研磨分离 后的细胞沉淀，能有效去除多糖，减少后续多糖对提取的影响；再一方面，增加CTAB的浓度 至3%，能更有效的去除多糖。因而，本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提 取方法，能有效去除多糖多酪，减少糖和酪类物质对核酸提取的影响，提高DNA的质量和浓 度；且本专利技术的实施方式所提供的基因组提取方法耗时短，成本低廉，相较试剂盒，能节约 成本，提高浓度，满足后续实验的需求。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提取方法中，步骤（1) 中的核酸分离缓冲液中包含下述组分：200mM化is、250mM化cl、50mM邸TA和质量浓度为 4%PVP，提高了核酸分离缓冲液中PVP的浓度，能有效地去除多酪W及代谢物质，能降低后 续裂解多酪物质多提取的影响。 优选地地，本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提取方法中，步骤 (1)中对待提取植物材料研磨之前，W液氮将所述待提取植物材料冻存。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提取方法中，步骤（1) 中加入核酸分离缓冲液时，每100毫克待提取植物材料加入1~2毫升核酸分离缓冲液。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提取方法中，在进行 步骤（4)之前，对步骤做重复2~3次。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提取方法中，步骤巧） 中所述的酪/氯仿/异戊醇混合液中，按体积比计，酪：氯仿：异戊醇为25:24:1 ;步骤化） 中的氯仿/异戊醇混合液中，按体积比计，氯仿：异戊醇为24:1。上述提取试剂中，酪使蛋 白质变性，同时抑制了raase的降解作用；氯仿可加速有机相与液相的分层。在抽提DNA的 过程中，为了混合均匀，通常进行剧烈震荡，此时会在混合液内产生大量气泡，而异戊醇的 作用是降低分子表面张力，因而能在提取过程中减少气泡的产生。为使酪、氯仿和异戊醇在 DNA提取过程中更好地发挥上述作用，步骤巧）中所使用的酪/氯仿/异戊醇混合液中，按 体积比计，酪：氯仿：异戊醇为25:24:1 ;步骤化）中使用的氯仿和异戊醇的最佳体积比为 24 :1。 优选地，本专利技术的实施方式所提供的多糖多酪植物基因组的提取方法中，步骤（7) 中，加入化C1的体积为所述上清体积的1/2 ;加入冰异丙醇的体积为所述上清体积的2/3。【附图说明】 图1为【具体实施方式】中样本序号为1、2的多糖多酪植物样本材料提取到的基因组 DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道号为样本序号； 图2为【具体实施方式】中样本序号为3、4的多糖多酪植物样本材料提取到的基因组 DNA进行琼脂糖凝胶电泳结果，其中，泳道号为样本序号。【具体实施方式】 为使本专利技术的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本专利技术的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可W理解，在本专利技术各实施方式中， 为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有运些技术细节和基 于W下各实施方式的种种变化和修改，也可W实现本申请各权利要求所要求保护的技术方 案。当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种多糖多酚植物基因组的提取方法，其特征在于，包含下述步骤：(1)取待提取植物材料，研磨后加入核酸分离缓冲液和2‑巯基乙醇，并使所述2‑巯基乙醇的终浓度为1％～5％，震荡混匀后，置于75～95度水浴中5～30分钟；(2)从水浴中取出，离心机中离心，弃掉上清液；(3)加入1×PBS溶液，研磨仪上震荡混匀，离心，弃上清；(4)向沉淀中加入500～1000ul预热的3×CTAB裂解液并混匀，65度水浴裂解30～60分钟；(5)加等体积的酚/氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；(6)取上清，加入等体积的氯仿/异戊醇混合液，混匀，离心；(7)取上清，加入NaCl和冰异丙醇，上下颠倒混匀，在‑20～‑80度环境下沉淀1～3小时；(8)取出，离心后，将沉淀用乙醇洗涤，风干后加TE溶解，即得到所提取的基因组。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙子奎，王锋，丁方美，李嫦娥，刘艳艳，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31