本发明专利技术公开了一种改造转运蛋白Bap2p促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法，属于微生物遗传和分子生物学领域。本发明专利技术消除Bap2p的泛素化位点，从而解除Bap2p所受到的泛素化调控。弱化了酿酒酵母受到的泛素化调控，提高了其对支链氨基酸的利用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及一种改造转运蛋白Bap化促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法，属于 微生物遗传和分子生物学领域。
技术介绍
转运蛋白Bap化是一种位于细胞膜上的支链氨基酸特异性透性酶，转运的氨基酸 包括亮氨酸化eu)、异亮氨酸（lie)和鄉氨酸（Val)，对于Leu具有很高的亲和力。泛素化 是蛋白质翻译后修饰的主要方式之一，被泛素标记的蛋白质将进入泛素-蛋白酶体途径， 并进一步被液泡内的蛋白酶所降解。Bap化受到泛素化调控，即Bap化的泛素化位点（赖 氨酸）被泛素所识别并标记，并最终被蛋白酶所降解。因此，解除或减轻Bap化的泛素化修 饰，从而减少其降解，将有助于其在细胞膜上的稳定存在并发挥氨基酸转运功能。 亮氨酸、异亮氨酸和鄉氨酸等支链氨基酸为酿酒酵母非偏好型氮源，当培养基中 存在偏好型氮源（谷氨酷胺、天冬酷胺、谷氨酸等）时，酿酒酵母优先利用偏好型氮源；只有 当偏好型氮源耗尽时，才开始利用非偏好型氮源。酿酒酵母运种优先利用偏好型氮源的方 式会带来许多不利的结果，如（1)不利于对氮源的充分利用，（2)有害代谢产物（如氨基甲 酸乙醋）的积累等。因此，减弱支链氨基酸转运蛋白Bap化受到的泛素化调控，使其能够在 细胞膜上发挥稳定功能，有助于提高支链氨基酸的利用，从而有助于氮源的全面充分利用， 且不会造成氨基甲酸乙醋等有害产物的积累。
技术实现思路
本专利技术要解决的问题是提供一种改造转运蛋白Bap化促进酿酒酵母利用支链氨 基酸的方法。 阳0化]所述的改造转运蛋白Bap化，是消除Bap化的泛素化位点，从而解除Bap化所受到 的泛素化调控。 阳006]所述的消除Bap化的泛素化位点，是将其第12和/或13和/或38和/或69位 赖氨酸突变为精氨酸。 阳007]在本专利技术的一种实施方式中，编码所述转运蛋白Bap化的核巧酸序列如SEQID NO. 1所示。 在本专利技术的一种实施方式中，所述的将赖氨酸突变为精氨酸，是不同的突变位点 的组合。 在本专利技术的一种实施方式中，所述的将赖氨酸突变为精氨酸，是将第12、13、38和 69位赖氨酸全部突变为精氨酸，得到突变体Bap化 所述的支链氨基酸指的是亮氨酸、异亮氨酸和鄉氨酸。 本专利技术对酿酒酵母支链氨基酸转运蛋白进行了遗传改造，弱化了其受到的泛素化 调控，提高了其对支链氨基酸的利用。【附图说明】 图1定点突变的组合方式 图2Bap化系列突变体支链氨基酸利用情况【具体实施方式】 材料与方法 阳01引 下述实施例所用酿酒酵母菌株为S.cerevisiaeCEN.PK2-lD-Aubi4(MATa ura3-52 ;t巧 1-289 ;leu2-3, 112 ;his3A1 ;Aubi4: :LEU2 ;MAL2-8c;SUC2)单倍体模式菌 株，酿酒酵母CEN.PK2-1D-Δubi4 由酿酒酵母CEN.PK2-1D(MATαura3-52 ;t巧 1-289 ; leu2-3, 112 ;his3A1 ;ML2-8c;SUC2)敲除基因UBI4 改造而来，酿酒酵母CEN.PK2-1D购自 抓R0SCARF(化anlrfud，Germany)，其他操作均为常规分子生物学操作。 实施例1 YNB液体培养基：1. 74g/LYeastNitrogenBasewithoutAminoAcidsand AmmoniumSulfate，20g/LD-glucose，5g/L(NH4)2S〇4。亮氨酸、尿喀晚双缺陷型培养基 (DM-leu，ura) :YNB培养基中添加50μg/mL组氨酸、50μg/mL色氨酸。固体培养基为相 应的液体培养基中加入20g/L琼脂粉。 W酿酒酵母S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Δubi4基因组DNA为模版，使用引物对 BAP2-F/BAP2-R(表1)扩增得到基因BAP2 (沈QIDNO. 1)。BAP2经挑取单菌落及Sanger测 序验证正确后，通过限制性酶切位点Notl和Smal连接至载体P化Detecl6(SEQIDNO. 2)， 得到重组表达载体邮bDetecl6-BAP2。重组表达载体使用引物对邮bDeteclG-ver-F/ R(表1)进行验证。挑选测序正确的重组质粒利用醋酸裡转化法转化S.cerevisiaeCEN. PK2-1D-Aubi4,涂布DM-leu，ura固体培养基。于30°C培养箱培养3-4d，挑选单菌落进行 菌落PCR验证后接种相应的液体培养基。待生长至对数期转接W便于后续试验。 酿酒酵母的醋酸裡转化法：将S.cerevisiaeCEN.PK2-1D-Aubi4在YTO培养基中 30°C，200巧m培养过夜后，转接至新鲜的40血YTO培养基中，并使终浓度为106cell·血1。 30°C，200巧m培养约化，待菌体生长至浓度为1. 2-1. 5X107cell·血1(0〇6。。= 1. 2-1. 5)。 收集菌体于4000rpm4°C离屯、5min收集全部细胞，用1倍体积的预冷无菌水洗涂细胞。 4000巧m4°C离屯、5min收集细胞，用1/2体积的预冷无菌水洗涂细胞。4000巧m4°C离 屯、5min收集细胞，加入4mL转化液并用移液枪将细胞和转化液混合均匀，室溫解育30min。 4000巧m4°C离屯、5min收集细胞，用1血Imol·L1山梨醇悬浮细胞并转移至1. 5血离屯、 管中。室溫1300化pm离屯、30s，弃上清，重复该步骤两次。用100μLImol.Li山梨醇悬 浮细胞，使终浓度为l〇"cell·血1。取40μΙ制备的感受态细胞并加入5yL(l〇〇yg)质 粒或线性DNA，混合后转入冰上预冷的0. 2cm电转杯中，冰上解育5min。将电转杯放入电转 仪中，参数设定为1. 5kV、25μΡ，电击后立即加入ImLlmol·L1山梨醇。用移液枪混合均匀 后（轻轻吹吸，不要产生气泡），将得到的电击混合物转移至1. 5mL离屯、管中，30°C静置解育 比。取0. 2mL涂布相应的营养缺陷型平板，置于30°C培养箱3-4d后观察结果。 表1P化Detecl6-BAP2表达载体构建及验证所用引物 泛素化位点的定点突变：采用定点突变的方法，将相应的泛素化位点（赖氨 酸）突变为精氨酸。采用快切酶化nl消化模板的方法进行定点突变。首先，W重组质粒 P化Detecl6-BAP2为模板，使用2XSuperP化MixDNA聚合酶扩增完整的重组质粒。PCR产 物经柱回收后添加化nl于37°C，反应比，由于菌体自身的质粒模板会被甲基化修饰，而扩 增的质粒则不会被甲基化。通过化nl消化后就可W消除原始模板质粒。将酶切反应后的 混合液于PCR仪80°C，5min使酶失活后即可转化E.coliJM109。转化体系涂布含有适量氨 节青霉素的LB平板，于37°C培养箱中静置过夜培养。随机挑取单菌落进行菌落PCR验证， 验证引物采用邮bDetecl6-ver-F/R。经Sanger测序验证正确的单克隆继续用于下一轮突 变，直到完成四重突变，定点突变的位点顺序如图1。 表2P化Detecl6系列表达载体定点突变所用引物 泛素化位点消除对支链氨基酸代谢的影响：分别将活化的CEN. PK2-lD-Aubi4、CEN.PK2-lD-Aubi4本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进酿酒酵母利用支链氨基酸的方法，其特征在于，是消除酿酒酵母转运蛋白Bap2p的泛素化位点，从而解除Bap2p所受到的泛素化调控。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周景文，陈坚，吕永坤，堵国成，李应宇，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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