桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮podoverine B和podoverine C的制备方法及其应用技术

本发明专利技术涉及桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C的制备方法，可有效解决快速从桃儿七中制备两个异戊烯基化双黄酮类化合物的问题，方法是，将桃儿七粉碎成粗粉，用乙醇回流提取，乙醇提取液减压浓缩至无醇味，乙酸乙酯萃取，得桃儿七粗提取物；对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，再高速逆流色谱纯化，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。本发明专利技术方法稳定可靠，效率高，时间短，产率高，可快速从桃儿七中分离得到两个异戊烯基化双黄酮类化合物，且纯度高，并经活性试验表明对前列腺癌细胞PC-3具有细胞毒活性，有效用于制备治疗前列腺癌的药物，经济和社会效益显著。

【技术实现步骤摘要】
桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮podoverineB和podoverineC的制备方法及其应用
本专利技术涉及医药领域，特别是一种桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮podoverineB和podoverineC的制备方法及其应用。
技术介绍
恶性肿瘤是一种严重威胁人类健康和生命的常见病、多发病。现今，癌症已成为全世界首要的致死病因。前列腺癌是男性最常见的恶性肿瘤之一，在美国和欧洲成年男性的恶性肿瘤中发病率最高。而随着人们生活条件逐渐改善，人均寿命不断延长以及饮食结构发生的巨大变化，前列腺癌的发病率和死亡率在我国均有逐渐升高的趋势，且发现时已多属中晚期，约有80％的病人首先被发现有远处转移病灶，然后才确诊为前列腺癌。对于转移性晚期前列腺癌主要治疗方法是内分泌治疗，然而经过几个月的治疗后，对内分泌敏感的前列腺癌常常转变为激素非依赖型前列腺癌，并且对常规治疗方案都产生耐受性。中草药在抗肿瘤方面的应用历史悠久，为改变晚期前列腺癌治疗的困境，从中草药中寻找高效低毒的抗前列腺癌活性物质，研制选择性强、毒副作用低的新型抗前列腺癌药物是药学科研工作者迫切解决的首要问题。桃儿七是小檗科桃儿七属植物鬼臼(Sinopodophyllumemodi(Wall.)Ying)的干燥根及根茎。鬼臼是一种具有悠久历史的药用植物，古代《神农本草经》中就有记载：杀大毒，疗咳嗽喉疾，风邪烦感，失魄妄见，不入汤。以后的历代本草亦多有记载，主要用于活血散结、祛风除湿、虫蛇咬伤、跌打、心胃痛、风寒咳嗽、月经不调、铁棒锤中毒、风湿筋骨痛及气管炎等症。鬼臼分布比较广泛，我国主要分布在四川、青海、西藏、甘肃、陕西。关于桃儿七的化学成分研究表明主要含有木脂素和简单取代的黄酮类化合物。双黄酮类化合物首次在该属植物中被发现，该类成分具有重要而广泛的生物活性如抗肿瘤、抗菌、抗病毒、抗炎、抗氧化、镇痛、扩张血管、抗凝血等。双黄酮类化合物是由两个黄酮单体经过C-C键或C-O-C键聚合而成，一般与其他类天然产物共存或在植物体内含量较低，且具有复杂的结构，对于该类成分的提取分离仍旧是一项具有挑战性的工作。截止目前，异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC仅仅从植物八角莲(Podophyllumversipelle)的细胞培养物中提取分离得到。具体的提取分离过程为，八角莲的细胞培养物采用甲醇作为溶剂连续回流提取，甲醇提取物采用XAD-2Amberlite大孔树脂柱色谱划分为三个组分，含有目标成分的第二个组分经过反相制备高效液相色谱进行分离，得到的单体化合物最后再经过色谱柱纯化。该提取分离方法涉及到3次色谱操作，分离周期较长，并且由于所用的吸附剂对目标成分的不可逆吸附，会导致样品的回收率降低。高速逆流色谱是一种新型的无固相载体的连续液液分配色谱技术，近年来广泛应用于生命科学、中医药、现代农业等领域活性成分的分离纯化。高速逆流色谱技术不需要任何固态载体，避免样品与固相载体的作用而产生样品的变性、失活和不可逆吸附等，同时还具有高效、快速、样品制备量大、回收率高、费用低等优点。现有的异戊烯基化双黄酮类化合物的分离方法中，尚未见凝胶柱色谱法和高速逆流色谱法相结合用于桃儿七中异戊烯基化双黄酮单体分离的有关技术报道。据文献报道podoverineB和podoverineC具有抗炎活性，对化学发光抑制的IC50值分别为6.4×10-6mol/L和8.9×10-5mol/L。本专利技术所涉及的podoverineB和podoverineC的逆流色谱分离和抗肿瘤活性(前列腺癌)，迄今为止未见有专利或文献报道。
技术实现思路
针对上述情况，为克服现有技术缺陷，本专利技术之目的就是提供一种桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC的制备方法，可有效解决快速从桃儿七中制备两个异戊烯基化双黄酮类化合物的问题。本专利技术解决的技术方案是，一种桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC的制备方法，其分子结构式分别为：制备方法是：1)、粗提取物的制备：将桃儿七3-6kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七6-12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90-95℃回流提取2-4次，得乙醇提取液，每次1.5-2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量7-12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min-1，每7-10mL为1个流份，共收集50-60个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4-6︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，100-110℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverineB和podoverineC的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10-14小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100-200mg，分别加入浓缩物20-50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为750-850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25-27℃，高速逆流色谱仪转速750-850r/min，流动相流速2.0-2.2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC。所述方法制备的桃儿七中两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC在制备抗前列腺癌药物中的应用。本专利技术方法稳定可靠，效率高，时间短，产率高，可快速从桃儿七中分离得到两个异戊烯基化双黄酮类化合物，且纯度高，并经活性试验表明对前列腺癌细胞PC-3具有细胞毒活性，有效用于制备治疗前列腺癌的药物，经济和社会效益显著。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术的具体实施方式作详细说明。实施例1桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC的制备方法，由以下方法实现：1)、粗提取物的制备：将桃儿七3kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B(1)和podoverine C(2)的制备方法，其特征是，分子结构式分别为：制备方法是：1)、粗提取物的制备：将桃儿七3‑6kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七6‑12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90‑95℃回流提取2‑4次，得乙醇提取液，每次1.5‑2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量7‑12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇‑水系统进行梯度洗脱，流速为0.6‑1mL/min‑1，每7‑10mL为1个流份，共收集50‑60个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4‑6︰1的二氯甲烷‑甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸‑乙醇溶液作为显色剂，100‑110℃加热3‑5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverine B和podoverine C的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10‑14小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100‑200mg，分别加入浓缩物20‑50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min‑1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为750‑850r/min，同时流动相以2mL/min‑1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25‑27℃，高速逆流色谱仪转速750‑850r/min，流动相流速2.0‑2.2mL/min‑1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverine B和podoverine C。...

【技术特征摘要】
1.一种桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB(1)和podoverineC(2)的制备方法，其特征是，分子结构式分别为：制备方法是：1)、粗提取物的制备：将桃儿七3-6kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七6-12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90-95℃回流提取2-4次，得乙醇提取液，每次1.5-2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量7-12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.6-1mL/min-1，每7-10mL为1个流份，共收集50-60个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4-6︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，100-110℃加热3-5min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverineB和podoverineC的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置10-14小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100-200mg，分别加入浓缩物20-50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为750-850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25-27℃，高速逆流色谱仪转速750-850r/min，流动相流速2.0-2.2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC。2.根据权利要求1所述的桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC的制备方法，其特征是，由以下方法实现：1)、粗提取物的制备：将桃儿七3kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七12倍重量的体积浓度为95％的乙醇90℃回流提取3次，得乙醇提取液，每次1.5小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量12倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为1mL/min-1，每7mL为1个流份，共收集55个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比5︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，105℃加热3min，根据薄层色谱检测结果合并含有目标成分podoverineB和podoverineC的流份，45℃减压回收溶剂，得到含有目标成分的浓缩物；3)、高速逆流色谱纯化：取体积比为3.5︰5︰3.5︰5的正己烷︰乙酸乙酯︰甲醇︰水，置于分液漏斗中，充分振摇均匀，静置12小时，分别取上部液相和下部液相，取含有目标成分的浓缩物各100mg，分别加入浓缩物50倍重量的上部液相和下部液相中，超声溶解，得到含有目标成分的超声溶液，用高速逆流色谱仪进行纯化，方法是：另取上部液相为固定相、下部液相为流动相，固定相以2mL/min-1流速注满高速逆流色谱仪的螺旋管，然后转速调为850r/min，同时流动相以2mL/min-1流速泵入螺旋管，待两相在高速逆流色谱仪的色谱柱中达到动态平衡后，由进样阀注入超声溶液，开启检测器和记录仪进行分离，超声溶液分离的检测波长为254nm，温度为25℃，高速逆流色谱仪转速850r/min，流动相流速2mL/min-1，根据色谱图分别收集目标成分，减压回收溶剂至干，即得两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC。3.根据权利要求1所述的桃儿七中分离的两个异戊烯基化双黄酮类化合物podoverineB和podoverineC的制备方法，其特征是，由以下方法实现：1)、粗提取物的制备：将桃儿七5kg粉碎成过40目筛的粗粉，用桃儿七10倍重量的体积浓度为95％的乙醇95℃回流提取2次，得乙醇提取液，每次2小时，合并乙醇提取液，减压浓缩至无醇味，得浓缩物，加浓缩物重量10倍的蒸馏水混悬，得混悬液，加入混悬液等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并乙酸乙酯萃取层，减压回收溶剂，得到乙酸乙酯萃取部位的浸膏，即为桃儿七粗提取物；2)、凝胶柱色谱初步分离：对桃儿七粗提取物经凝胶柱色谱初步分离，分别采用体积比为5︰5、6︰4的甲醇-水系统进行梯度洗脱，流速为0.8mL/min-1，每9mL为1个流份，共收集55个流份，各个流份经硅胶薄层色谱检测分析，采用GF254薄层板，以体积比4︰1的二氯甲烷-甲醇作为展开剂，以体积比10︰90的硫酸-乙醇溶液作为显色剂，100℃加热5mi...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙彦君，宋军营，高美玲，王俊敏，张艳丽，裴莉昕，纪宝玉，王凯波，孙印石，
申请(专利权)人：河南中医学院，
类型：发明
国别省市：河南;41