使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶使错误最小化制造技术

本文提供涉及核酸的酶修饰的技术，和特别但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由胞嘧啶残基的脱氨作用导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的方法和组合物。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶使错误最小化本申请要求提交于2013年3月14日的美国临时专利申请系列号61/782，698的优先权，其通过引用以其整体结合到本文中。专利
本文提供涉及核酸的酶修饰的技术，和特别但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶以使由胞嘧啶残基的脱氨作用导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的方法、试剂盒和组合物。背景PH、温度、离子强度、压力等的变化经常用于分子生物学过程和测定法以引起样品组分例如核酸、蛋白、辅因子等变化。然而，特定样品组分(例如特定蛋白)的一些分子生物学操作对其它样品组分(例如核酸)产生不需要的影响。例如，在分子生物学中使用热活化的酶需要一段加热的时间(例如，在95°C 10-20分钟)以活化酶。在该加热期间，存在于样品中的核酸(例如DNA)也受到加热。加热核酸诱导胞嘧啶的脱氨作用(参见例如Lindahl和Nyberg (1974)^Heat-1nduced deaminat1n of cytosine residues in deoxyribonucleicacid (在脱氧核糖核酸中胞啼啶残基的热诱导的脱氨作用)”，B1chemistry\3(16):3405)，其导致将胞嘧啶碱基转化成尿嘧啶碱基。而胞嘧啶碱基与鸟嘌呤配对，尿嘧啶碱基与腺嘌呤配对。因此，在互补DNA链的合成期间尿嘧啶碱基编码腺嘌呤。在DNA链中的该起始的错误导致在随后自损坏的模板合成的DNA链中G至A的突变和/或C至T的突变。尽管具有2百万个碱基的单链DNA分子在pH 7.4和37°C每2.8小时将经历涉及胞嘧啶的单脱氨作用事件，但95°C孵育DNA以大约2 X 10 _7次脱氨作用事件/秒的速率诱导胞嘧啶的脱氨作用(参见例如Lindahl和Nyberg，同上)。根据该速率，在95°C加热DNA 10分钟以大约1个/8333个胞嘧啶引起胞嘧啶转变为尿嘧啶。因此，该速率是意义重大的，因为分子生物学样品经常包含超过百万(或甚至超过十亿)个胞嘧啶残基。该转变对于单核苷酸多态性(SNP)检测测定是个问题，在所述测定中检测靶向的SNP为G至A或C至T转变。例如，在加热活化期间大约1个/8333个拷贝野生型序列将转变成突变体拷贝，因此产生SNP存在于样品中的假阳性结果。因此，需要在分子生物学过程中解决核酸的热脱氨作用的技术。简述 因此，本文提供涉及核酸的酶修饰的技术，和特别但不限于涉及使用尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(一种“UDG”酶，通常由称为UNG的基因编码)以使由胞嘧啶残基的脱氨作用(例如，由于加热DNA导致)导致的DNA序列的错误最小化或消除所述错误的方法和组合物。在DNA分子可用作DNA合成的模板之前，尿嘧啶-DNA糖基化酶通过从DNA分子消除尿嘧啶阻止将C至U和G至A的突变固定到复制的DNA中。通过将损坏的碱基弹出双螺旋和切割N-糖苷键，尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶切割连接尿嘧啶碱基与DNA骨架的N-糖苷键，从而除去损坏的含氮碱基和留下完整的糖-磷酸骨架。作为该过程的结果，在DNA链中产生脱碱基位点(亦称为脱嘌呤/脱嘧啶位点或AP位点)。脱碱基位点引起聚合酶停止。在一些条件下，脱碱基位点引起DNA链的中断(例如，自发地和/或由于在脱碱基位点上切割核酸的酶的作用)。在任一情况下，聚合酶不继续越过脱碱基位点，因此不引入碱基到脱碱基位点相对的互补链中。因此，聚合酶不产生与损坏的DNA模板互补的突变体DNA链，所述损坏的DNA模板由损坏的寡核苷酸引物引发导致，或因为各种分子生物学方法中的其它损坏的核酸导致。因此，损坏的碱基不引起样品中的突变体序列的扩增。没有该活性的情况下，在DNA合成期间自损坏的C产生的U指导聚合酶掺入A而不是G到相对互补链中；后续轮合成掺入T到错误的A的对面。结果，起始的脱氨作用事件导致将C至T和G至A的突变固定到所有后续拷贝中。C碱基的脱氨作用因此在天然群体中导致突变。此外，在合成扩增核酸的方法(例如在聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应、引物延伸反应和其它扩增反应，如下文更详细描述)中，C碱基经脱氨作用产生U碱基是明显成问题的。作为实例，在PCR期间DNA的扩增按指数发生。结果，表示样品中小比例的核酸的较少事件，例如单DNA链中的单C碱基的脱氨作用，被扩增和在PCR期间和在PCR的终产物中以显著量呈现。此外，后面的PCR循环的坪效应导致在最终的扩增产物中过度呈现起始较少种类的核酸。通过PCR-相关的热循环期间的已知诱导C碱基的脱氨作用的加热期，这些脱氨作用问题加重。因此，本文提供的技术涉及从DNA中识别和除去U碱基的酶。在一些实施方案中，所述酶自热稳定的生物分离。热稳定的酶通过许多方法产生，和热稳定的酶的来源不限制所述技术。例如，在一些实施方案中热稳定的酶是自嗜热生物(例如，古细菌(Archaea)的嗜热成员例如闪烁古生球菌(Archaeglobus fulgidis))分离的酶。所述技术包括组合物、方法和反应混合物，其包括(或包括使用)以下酶:从DNA中识别和除去U碱基的天然热稳定的酶，例如天然热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；从DNA中识别和除去U碱基的重组体热稳定的酶，例如重组体热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；从DNA中识别和除去U碱基的野生型热稳定的酶，例如野生型热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；从DNA中识别和除去U碱基的突变体热稳定的酶，例如突变体热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶；和/或从DNA中识别和除去U碱基的工程改造的热稳定的酶，例如工程改造的热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶。在一些实施方案中，所述酶自嗜温生物分离和是热稳定的酶。在一些实施方案中，热稳定的酶通过例如随机诱变、计算机建模、合理(定向)诱变、合理(定向)酶设计、体外进化(例如SELEX)等方法自较不热稳定的酶产生。在一些实施方案中，所述酶是冷稳定的酶(例如，自嗜冷或喜低温的生物分离)，其也是热稳定的。在一些实施方案中，所述酶是尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶(“UDG”或“UNG” )。热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶是市购可得的。此外，几种热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶的核苷酸序列和/或氨基酸序列是已知的，和许多生物(包括许多嗜热生物)的基因组序列是已知的。因此，可购买热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶，或根据已知的核苷酸和/或蛋白序列和可得的基因组序列从生物分离热稳定的尿嘧啶-DNA-N-糖基化酶，例如通过PCR (例如，使用靶向保守区的引物，使用简并引物)、探针方法或通过完全体外合成。嗜热生物区别于嗜温生物之处在于特征例如它们的最适生长温度(例如，高于嗜温生物的最适生长温度)和基因组特征(例如，更高的GC含量)。因此，在一些实施方案中，所述技术提供与热稳定的UDG相关的方法和组合物，所述UDG在加热期间保持其活性，例如，在PCR的加热步骤、测序反应的加热步骤、样品制备的加热步骤期间和/或在高温例如在60°C或更高、70°C或更高、80°C或更高、90°C或更高、或95°C或更高下孵育期间。例如，一些PCR方法使用热活化的聚合酶例如热活化的Taq聚合酶。经常，聚合酶保持无活性，直到在95°C或更高下加热。在该加热期间，发生本文档来自技高网...

【技术保护点】
组合物，包括包含靶序列的靶核酸、聚合酶、尿嘧啶‑DNA糖基化酶和包含尿嘧啶碱基的损坏的核酸。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：A夏，W蔡，
申请(专利权)人：雅培分子公司，
类型：发明
国别省市：美国;US