实时电子测序制造技术

描述了实时电子测序方法、装置和系统。使用包含具有一个或两个电极的电容装置的纳米电子元件的阵列或纳米FET装置的阵列来提供聚合酶-模板复合物中模板核酸的序列信息，所述聚合酶-模板复合物结合至纳米级电子元件附近或结合至纳米级电子元件附近的基材。在聚合酶介导的核酸合成的条件下将包含具有阻抗标记物、电容标记物或电导标记物的核苷酸类似物的测序反应混合物导入包含电容装置或纳米FET的纳米级电子元件的阵列。使用测量的阻抗、电导或电容通过鉴定掺入生长链的核苷酸类似物的标记物的类型来确定核苷酸类似物掺入的时间顺序。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】实时电子测序相关申请的交叉参考本申请要求2013年9月20日提交的临时专利申请号61/880,293和2013年5月6日提交的临时专利申请号61/820,066的权益，其通过引用纳入本文用于所有目的。关于联邦资助研究/开发的声明不适用。
技术介绍
核酸序列数据在生物学研究和分子医疗中的许多应用中是有价值的，包括测定疾病中的遗传性因素，开发新方法以检测疾病并指导治疗(vandeVijver等(2002)"Agene-expressionsignatureasapredictorofsurvivalinbreastcancer,(作为乳腺癌中存活预测的基因表达特征)"NewEnglandJournalofMedicine347:1999-2009)，以及提供个性化医疗的合理基础。获得并验证用于这类分析的序列数据促使测序技术需要经历进步以扩大通量、减少试剂和劳动成本并提高精确性(参见例如，Chan等，(2005)"AdvancesinSequencingTechnology(测序技术中的进步)"(综述)MutationResearch573:13-40，其全文纳入本文用于所要目的)。使用了多种测序方法且各自具有其优势和劣势。单分子实时测序优于其他测序方法，包括提供较长读取长度的能力。许多目前的测序方法使用光学标记物。需要使用非光学读取的改进的测序仪器和方法，且尤其是具有这些特性的实时单分子测序方法。已阐述了单分子和单颗粒的电子检测，包括通过电容、阻抗和电导方法。本专利技术提供了用于非光学实时单分子测序的仪器、装置和方法。
技术实现思路
在一些方面中，本专利技术提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含可测量阻抗的纳米级电子元件的阵列的基材，其中多个纳米级元件包含与纳米级电子元件接合或靠近的单个聚合酶复合物(包含聚合酶和模板核酸)；将该基材暴露于多种类型的核苷酸类似物，各类型包含与核苷酸类似物的磷酸部分相连的不同的阻抗标记物，暴露的条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致掺入核苷酸类似物和切割相应的阻抗标记物，并导致新生核酸链的生长；测量多个纳米级电子元件中每一个处的阻抗，当核苷酸类似物存在于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的阻抗标记物生成纳米级电子元件处可测量的阻抗变化；随时间监测多个纳米级元件处的阻抗，阻抗的变化表示某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用随时间测量的阻抗鉴定掺入的核苷酸类似物的类型以确定模板核酸的序列。在一些情况中，这些纳米级电子元件测量电容、电导或电容和电导的组合。在一些情况中，这些纳米级电子元件包括纳米FET装置。在一些情况中，纳米FET的栅包含纳米线。在一些情况中，纳米FET的栅包含掺杂硅。在一些情况中，该基材暴露于四种类型的核苷酸类似物，其对应于A、G、C、T或A、G、C、U，这四种类型的核苷酸类似物各自具有不同的阻抗标记物。在一些情况中，该阻抗标记物与聚磷酸部分通过接头相连。在一些情况中，该阻抗标记物包含电容标记物或电导标记物。在一些方面中，本专利技术提供了用于测序多种单核酸模板分子的芯片，包含：一种基材，其包含；多个纳米级电子元件，各纳米级电子元件包含与纳米级电子元件结合或与纳米级电子元件最近的基材结合的单个聚合酶复合物，各聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；各基材设置成使得纳米级电子元件接触包含多种类型的核苷酸类似物的测序反应混合物，这些核苷酸类似物各自具有不同的阻抗标记物；以及多个电连接位点，其用于向纳米级电子元件提供电流和电压，并用于接收来自纳米级电子元件的电信号。在一些情况中，这些纳米级电子元件包含纳米级电容装置或纳米FET装置。在一些情况中，这些纳米级电子元件包含纳米FET且各纳米FET的栅包含纳米线。在一些情况中，这些纳米级电子元件包含纳米FET且纳米FET的栅包含掺杂硅。在一些情况中，该基材包含超过1000个纳米级电子元件。在一些情况中，该基材包含超过10000个纳米级电子元件。在一些情况中，该基材包含约1000个纳米级电子元件至约1000万个纳米级电子元件。在一些情况中，该基材包含约10000个纳米级电子元件至约100万个纳米级电子元件。在一些情况中，该基材包含电子件用于以下一个或多个目的：向纳米级电子元件提供电信号，测量纳米级电子元件处的电信号，模拟数字转化，信号处理，以及数据储存。在一些情况中，这些电子件包含CMOS元件。在一些方面中，本专利技术提供了一种用于模板核酸测序的系统，包括：具有外壳电连接位点的外壳；与外壳可逆配合的包含基材的芯片，其包含；与外壳电连接位点可逆连接的芯片电连接位点；多个纳米级电子元件，各纳米级电子元件包含与纳米级电子元件结合或与纳米级电子元件附近的基材结合的单个聚合酶复合物，其中该聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；用于使测序反应混合物接触纳米级电子元件的流体储器，该测序反应混合物包含多种类型的核苷酸类似物，各类型具有不同的阻抗标记物，在类似物与聚合酶复合物相联系的同时这些阻抗标记物被纳米级电子元件感知；电子控制系统，其通过电连接与纳米级电子元件连接以向纳米级电子元件施加所需电信号并接收来自纳米级电子元件电信号；以及计算机，其随时间接收纳米级电子元件处电信号上的信息并使用这类信息鉴定模板核酸的序列。在一些方面中，本专利技术提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含纳米级电极的基材，该基材包含含有聚合酶和模板核酸的聚合酶复合物，该复合物与纳米级电极接合或与靠近纳米级电极的基材接合；将该聚合酶暴露于多种类型的核苷酸类似物，其各自包含与核苷酸类似物的磷酸部分接合的不同的电容标记物，暴露的条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致切割电容标记物和新生核酸链的生长；向纳米级电极随时间施加包含交流电的电信号，当核苷酸类似物存在于酶的活性位点中时，核苷酸类似物上的电容标记物生成纳米级电极处电容的可测量变化；随时间监测纳米级电极处的电信号，该电信号显示具有特定电容标记物的某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用电极处随时间监测的电信号确定模板核酸的序列。在一些实施方式中，以不同频率重复访问纳米级电极，其中，各频率处测得的电容被用于鉴定特定的电容标记物。在一些实施方式中，该聚合酶暴露于四种类型的核苷酸类似物，其对应于A、G、C、T或A、G、C、U，以至少8种不同频率重复访问纳米级电极。在一些实施方式中，施加于电极的电信号包括正弦波、三角波或锯齿波。在一些实施方式中，随时间变化的电容变化量被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。在一些实施方式中，电容关联频率的特征被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。在一些实施方式中，随时间变化的电容特征被用于鉴定掺入了何种类型的核苷酸。在一些实施方式中，酶与纳米级电容电极接合。在一些实施方式中，该电容标记物与聚磷酸部分通过接头接合。在一些方面中，本专利技术提供了一种核酸测序的方法，包括：提供包含至少两个纳米级电极的基材，该基材包含含有聚合酶和模板核酸的聚合酶复合物，该复合物与靠近纳米级电极的基材接合；将该聚合酶暴露于多种类型的核苷酸类似物，其各自包含与核苷酸类似物的磷酸部分接合的不同的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于核酸测序的方法，所述方法包括：提供包含能够测量阻抗的纳米级电子元件的阵列的基材，多个纳米级元件包含接合或靠近所述纳米级电子元件的单个聚合酶复合物，所述聚合酶复合物包含聚合酶和模板核酸；使所述基材接触多种类型的核苷酸类似物，各类型包含与所述核苷酸类似物的磷酸部分接合的不同的阻抗标记物，接触条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致掺入所述核苷酸类似物和切割相应的阻抗标记物，并导致新生核酸链的生长；测量所述多个纳米级电子元件中每一个处的阻抗，当核苷酸类似物位于所述酶的活性位点中时，所述核苷酸类似物上的阻抗标记物生成所述纳米级电子元件处可测量的阻抗变化；随时间监测所述多个纳米级元件处的阻抗，所述阻抗的变化表示某一类型的核苷酸类似物的掺入事件；以及使用随时间测量的阻抗鉴定掺入的核苷酸类似物的类型以确定模板核酸的序列。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.05.06 US 61/820,066;2013.09.20 US 61/880,2931.一种用于核酸测序的方法，所述方法包括：
提供包含纳米FET的阵列的基材，各纳米FET包含源、漏区和栅，多个纳米FET包含含有聚合酶和模板核酸的单个聚合酶复合物，所述复合物与所述纳米FET的栅接合或与靠近所述纳米FET的栅的基材接合；
提供多种类型的核苷酸类似物，各类型的核苷酸类似物包含通过接头与核苷酸类似物的磷酸部分接合的电导标记物，其中各类型的核苷酸类似物具有不同接头，并且各不同接头经选择以使各类型的核苷酸类似物表现出不同的电流振荡频率特性；
使所述基材接触多种类型的核苷酸类似物，接触条件为发生聚合酶介导的核酸合成，导致切割所述电导标记物和新生核酸链的生长；
在所述源和漏区之间施加电压，当所述核苷酸类似物位于所述酶的活性位点中时，所述核苷酸类似物上的电导标记物产生栅的电导的可测量变化；
随时间监测所述纳米FET处的电信号，所述电信号表示核苷酸类似物的掺入事件，其中所述电信号包括测量电流振荡频率，其中所述核苷酸类似物与所述聚合酶相关联时，所述核苷酸类似物的电流振荡频率特征用于鉴定掺入的核苷酸的类型；以及
使用所述监测的电信号确定所述模板核酸的序列，
其中，所述方法不需要核苷酸或核苷酸类似物上标记物的还原或氧化。


2.如权利要求1所述的方法，其中，用于确定所述模板核酸序列的监测的电信号还包括信号的持续时间，其表示核苷酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：S·特纳，J·哈尼斯，K·比约森，
申请(专利权)人：加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US