在无蛋白培养基中悬浮培养的MDCK来源的细胞系和使用该细胞系扩增病毒的方法技术

本发明专利技术涉及能够在无蛋白培养基中悬浮培养的新的MDCK来源的细胞系，以及使用所述MDCK细胞系扩增病毒以生产疫苗的方法。根据本发明专利技术的新的MDCK来源的细胞系对多种病毒表现出高且均一的生产力，并且具有低的致瘤能力且引起较少的病毒抗原变异，因此可以用于生产疫苗病毒。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能够在无蛋白培养基中悬浮培养的新的MDCK来源的细胞系，以及用 于使用这样的MDCK细胞系扩增病毒以生产疫苗的方法。
技术介绍
通常，受精鸡蛋被用于流感疫苗生产。然而，使用受精鸡蛋具有以下缺点：应养殖 并管理适于生产的小鸡；应将流感疫苗生产调整到受精鸡蛋的生产范围；以及鸡蛋蛋白不 能被完全清除，致使疫苗不适于接种给对鸡蛋蛋白过敏的人。 从很久之前，就已经进行了关于通过使用细胞培养来生产流感疫苗以替换具有上 述缺点的受精鸡蛋的研究。因为用于细胞培养的动物细胞是无限供给的，所以使用细胞培 养允许在短时间内大量生产。此外，其具有这样的优点：可以将疫苗接种给对鸡蛋蛋白过敏 的人；以及可以从细胞中分离不能从受精鸡蛋中分离的流感疫苗。此外，与在受精鸡蛋中相 比，在细胞中扩增的病毒显示出更少的病毒抗原基因突变。 由犬肾建立的马丁达比犬肾（Madin Darby canine kidney，在下文中称作 "MDCK"）细胞系显示出很强的表面粘附；已使用动物血清进行培养；并且需要很大的空间 进行大量生产，从而需要高的费用。另外，有报道称贴壁MDCK细胞系显示出高致瘤性。 因此，需要开发适于使用不含动物来源血清和蛋白质的培养基悬浮培养的新MDCK 细胞系，与常规的贴壁MDCK相比，其显示出显著较低的致瘤性。
技术实现思路
因此，本专利技术的一个目的是提供能够在无蛋白培养基中悬浮培养的新的MDCK来 源的细胞系，其具有低致瘤性且引起较少的病毒抗原变异，因此可以用来生产用于疫苗的 病毒。 本专利技术的另一个目的是提供用于使用所述MDCK来源的细胞系扩增病毒以生产疫 苗的方法。 根据本专利技术的一个目的，提供了能够在无蛋白培养基中悬浮培养的马丁达比犬肾 (MDCK)来源的 MDCKS-MG 细胞系（登记号 KCLRF-BP-00297)。 根据本专利技术的另一个目的，提供了用于扩增病毒以生产疫苗的方法，其包括以下 步骤： 1)用所述病毒感染MDCK来源的MDCKS-MG细胞系（登记号KCLRF-BP-00297); 2)培养经所述病毒感染的所述MDCK来源的MDCKS-MG细胞系；以及 3)从步骤2)中获得的细胞培养物中分离所述病毒。 本专利技术MDCK来源的细胞系能够在无蛋白培养基中悬浮培养并且没有细胞生长缺 陷；对多种病毒表现出高且均一的生产力，同时引起较少的病毒抗原变异和低致瘤性；并 因此可以用来生产用于疫苗的病毒。【附图说明】 在结合附图时，通过本专利技术的以下描述，本专利技术的上述和其他目的以及特征将变 得明显。 图1和图2分别示出了候选细胞系A在悬浮培养适应期间的细胞状态和生长曲 线。 图3和图4分别示出了候选细胞系B在悬浮培养适应期间的细胞状态和生长曲 线。 图5和图6分别不出了候选细胞系A和候选细胞系B的传代培养结果。 图7至图9分别示出了 H1NUH3N2和乙型流感病毒在候选细胞系A和候选细胞系 B中之生产力的分析结果。 专利技术详述 本专利技术提供了能够在无蛋白培养基中悬浮培养的MDCK来源的MDCKS-MG细胞系 (登记号KCLRF-BP-00297,下文中也称作"候选细胞系B"）。 在不包含动物来源物质的无蛋白培养基中悬浮培养的本专利技术MDCK来源MDCKS-MG 细胞系没有细胞生长缺陷，表现出低致瘤性，并且对多种病毒显示出高且均一的生产力。 此外，与在EX-CELL MDCK培养基（市售的无血清培养基）中悬浮培养的其他MDCK 细胞系（例如，候选细胞系A)相比，在无蛋白Pr〇CH05培养基中悬浮培养的本专利技术MDCK来 源的MDCKS-MG细胞系显示出高达128倍更高的HA效价和高达IO 5倍更高的PFU效价，表 明了非常优异的流感病毒生产力（表5至表9)。而且，与候选细胞系A不同，本专利技术的细胞 系在培养3代后未显示出病毒HA-抗原的氨基酸序列突变（表11)，并且具有相对较低的致 瘤性（表13)。此外，由本专利技术细胞系生产的流感疫苗在小鼠中显示出优异的抗体形成能力 (表14)。因此，该细胞系可以用来生产用于疫苗的病毒。 本专利技术人将MDCK来源的候选细胞系B命名为"MDCKS-MG"，其于2013年5月15日 以登记号KCLRF-BP-00297保藏在韩国细胞系研究基金会。 在本专利技术中，"无蛋白培养基"指不含动物来源血清的无血清培养基，尤其是根本 不含分子量为IOkDa或更大添加的蛋白质的培养基。例如，本专利技术的无蛋白培养基优选是 根本不含添加的血清和蛋白质的ProCH05培养基。 可以例如根据包括以下步骤的方法生产本专利技术MDCK来源的MDCKS-MG细胞系： (a)将贴壁MDCK细胞（ATCC，CCL-34)解冻，然后将其在血清培养基中进行培养； (b)对步骤a)中获得的贴壁状态的细胞进行传代培养；以及 (C)如下使步骤b)中获得的细胞适应悬浮培养：每次传代都降低血清含量，用 ProCH05培养基（无血清）替换ProCH04培养基（2% FBS)，并在5% CO2培养箱中以120rpm 至130rpm对所述细胞进行搅拌。 下文中具体解释了用于使用下述步骤来生产本专利技术MDCK来源的MDCKS-MG细胞系 的方法。 步骤（a) 首先，用作亲本细胞的贴壁MDCK细胞的信息如下： 马丁达比犬肾（MDCK，ATCC)细胞。 在步骤（a)中，在将MDCK亲本细胞（ATCC，CCL-34)解冻后，在37°C和5% 0)2的 环境下于包含10%胎牛血清（FBS)的EMEM培养基中对其进行培养。 步骤（b) 在步骤（b)中，3天至4天后，通过使用0. 25%胰蛋白酶EDTA将步骤（a)中获得的 细胞悬浮在瓶底部，可以收获所述细胞。所述细胞可以以细胞量1 : 4至1 : 50的比在贴 壁状态下传代培养。传代比根据细胞生长速率可以不同，但是优选地，其为1 : 4至1 : 30。 步骤（C) 在步骤（C)中，通过以下过程使步骤b)中获得的细胞适应悬浮培养：每次传代都 降低血清含量，用ProCH05培养基（无血清）替换ProCH04培养基（2% FBS)，并在5% CO2 培养箱中以120rpm至130rpm对所述细胞进行搅拌。 通过降低血清含量使细胞适应悬浮培养，例如，在5% CO2培养箱中以120rpm至 130rpm对其进行搅拌：第0天至24天在ProCH04培养基（2 % FBS)中，第24天至32天 在ProCH04培养基（含1 % FBS)中，第32天至36天在ProCH04和ProCH05的混合培养基 (50 : 50，1%FBS)中，第36天至39天在ProCH04和ProCH05的混合培养基（33 : 67， 0. 5%FBS)中，第39天至42天在ProCH04和ProCH05的混合培养基（20 : 80)中，以及第 42天或更久在ProCH05培养基（无蛋白）中。 Pr〇CH05培养基可以包含L-谷氨酰胺（Lonza)，并且包含L-谷氨酰胺的商业产品 可以包括 GlutaMax?(invitrogen)、GlutaminePlus?(atlantabio)、CellBoost? (HyClone) 、RS-CH0? (Sheffield)等。 通过上述方法生产的MDCK来源的MDCKS-MG细胞系在每次传代本文档来自技高网...

【技术保护点】
能够在无蛋白培养基中悬浮培养的马丁达比犬肾(MDCK)来源的MDCKS‑MG细胞系(登记号KCLRF‑BP‑00297)。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：黄美嬉，朴国辰，辛德香，李贤，金秀仁，赵恩莹，金美淑，安东浩，
申请(专利权)人：财团法人牧岩生命工学研究所，
类型：发明
国别省市：韩国;KR