一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法技术

一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法，属于天然药物技术领域。其包括以下工艺步骤：以麦冬须根为原料，经乙醇提取、乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析获得仅含有甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物；甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物应用高速逆流仪器进行分离纯化；流出液用HPLC进行检测，分别将甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B纯度大于98％的洗脱液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到单体化合物。本发明专利技术能够高效、快速地将麦冬须根中的甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物有效分离，并且本发明专利技术与常规多次HSCCC制备相比，具有节省流动相，减少样品回收负担、节约时间等优势。

【技术实现步骤摘要】
一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法
本专利技术属于天然药物
，关于麦冬须根中化合物的分离纯化方法，具体涉及利用循环高速逆流色谱从麦冬须根提取物中分离出甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B的方法。
技术介绍
中药麦冬（OphiopogonisRadix）为百合科沿阶草属多年生常绿草本植物麦冬Ophiopogonjaponicus(L.f)Ker-Gawl.的干燥块根，为传统常用中药之一；具有养阴生津，润肺清心的功效；主治肺燥干咳、阴虚痨咳、喉痹咽痛、津伤口渴、内热消渴、心烦失眠、肠燥便秘等。本品主产于浙江省和四川省，分别被称为浙麦冬和川麦冬。研究表明，高异黄酮是麦冬中一类重要的小分子活性成分，其母核骨架碳数为16个，比通常的异黄酮类化合物的B环和C环之间多了一个亚甲基；这类化合物具有抗肿瘤、抗炎、抑制磷酸化、抗雌激素、抗诱变、镇咳、抗真菌、诱导血管舒张和肝细胞保护等多方面的生物活性和作用。甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B（结构式见图1）是麦冬中主要的高异黄酮类成分，但由于结构相似，在水、甲醇、乙腈等溶液中溶解度低。目前国内外所采用的硅胶柱层析、凝胶层析以及制备液相色谱等方法分离效果均不理想，通常无法在较短时间内使其得到有效分离，需进行多次纯化及重复制备，操作繁琐、费时费力。而且采用麦冬块根药材进行制备，成本高，还会大量消耗麦冬药材资源。麦冬须根是麦冬传统药用部位块根加工过程中的废弃物，通常作为动物饲料或直接丢弃。高速逆流色谱（HSCCC）一种基于液-液分配机理的新型色谱分离纯化技术。它不用任何固态的支撑物或载体，而是利用两相溶剂体系在高速旋转的螺旋管内建立起一种特殊的单向性流体动力学平衡。当其中一相作为固定相，另一相作为流动相，在连续洗脱的过程中能保留大量固定相。由于不需要固体支撑体，物质的分离依据其在两相中分配系数的不同而实现，从而避免了因不可逆吸附而引起的样品损失、失活、变性等，特别适合于天然生物活性成分的分离。但是实验发现单次常规的HSCCC分离甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物效果也不理想。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术的目的在于设计提供一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法的技术方案，该方法具有高效、快速、可在不改变硬件的条件下显著改善分离效果的优势。专利技术人对麦冬化学成分研究发现，麦冬须根中甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B成分含量显著高于块根中含量，因而可以选择麦冬须根为原料进行分离纯化。专利技术人试图利用一次HSCCC对麦冬须根中甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B进行分离，但由于目标化合物性质极为接近，分离效果不理想。专利技术人通过实验发现循环HSCCC可以显著提高分离效果；不同的流动相均可应用，只是分离效果和循环的次数有所不同。循环高速逆流色谱硬件条件与常规高速逆流色谱一致，只是在进样一定时间后将螺旋管出口与流动相泵的入口连接。因此在主机中经过一次分离后未完全分离的两个组分能够进入高速逆流色谱仪进行再分离，如此反复。当检测器上的两峰完全分离开之后,切断螺旋管出口和泵入口的连接，并在前者处收集流出物即可得到具有满意纯度的两种目标产物。本专利技术具体通过以下方法实现：所述的一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）以麦冬须根为原料，经乙醇提取、乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析获得仅含有甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物；2）步骤1）得到的甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物应用高速逆流仪器进行分离纯化，高速逆流仪器条件为将甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物溶于上相中，以10～20mL/min的速度向高速逆流色谱仪中泵入下相，待管路完全充满固定相后以600～1000rpm转动主机，同时以1～3mL/min的速度泵入流动相，运行一定时间后将螺旋管出口与流动相泵的入口连接，根据HSCCC分离情况，循环3～8次后，切断出口和入口的连接，从出口处收集流出物；3）步骤2）得到的流出液用HPLC进行检测，分别将甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B纯度大于98％的收集液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到单体化合物。所述的一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法，其特征在于所述的步骤1）中麦冬须根为浙麦冬须根和川麦冬须根。所述的一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法，其特征在于所述的步骤1）中硅胶柱层析条件：以石油醚和乙酸乙酯体积比为100:0、50:1、20:1、10:1、5:1分别洗脱，洗脱液根据HPLC检识合并。所述的一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法，其特征在于所述的步骤2）中高速逆流色谱两相溶剂体系正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶乙腈∶水体积比为2:1～3:1～4:0～1.5:0.5～2，或正己烷∶乙酸乙酯∶甲醇∶乙腈∶水体积比为2:1～3:1～4:0～1.5:0.5～2，上相为固定相，下相为流动相。本专利技术能够高效、快速地将麦冬须根中的甲基麦冬黄烷酮A和B混合物有效分离，并且本专利技术与常规多次HSCCC制备相比，具有节省流动相，减少样品回收负担、节约时间等优势。附图说明图1为甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B结构式；图2为甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B的混合物样品的HPLC谱图；图3为甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B的循环HSCCC谱图；图4为甲基麦冬黄烷酮A的HPLC色谱图；图5为甲基麦冬黄烷酮B的HPLC色谱图。具体实施方式以下结合实施例来进一步说明本专利技术。实施例1（1）甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物样品制备取浙麦冬的干燥须根6kg，粉碎后用30L80％的乙醇超声辅助提取2次，每次1h，过滤并合并滤液后，用旋转蒸发仪上回收提取溶剂。所得浸膏用水稀释后以乙酸乙酯萃取。乙酸乙酯浸膏（46.97g）过硅胶柱色谱，以石油醚∶乙酸乙酯（100:0、50:1、20:1、10:1、5:1）分别洗脱2000mL洗脱液根据HPLC检识合并，HPLC分析条件如下：色谱柱为ThermoC18（250mm×4.6mm，5μm)，柱温为30℃，流动相采用水-乙腈（35:65）；检测波长为285nm；流速设置为1mL/min。最终得到只含有甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物1.50g，HPLC检测色谱图见图2所示。（2）循环高速逆流色谱分离制备应用TBE-300A型高速逆流仪器（上海同田生物技术有限公司）将以上制得甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物分离纯化。高速逆流色谱两相溶剂体系正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶乙腈：水体积比2:1.5:1:1:1，在分液漏斗中充分振摇后放置4小时，使其充分分层。然后将两相分开，在上相作为固定相，下相作为流动相，超声脱气30min。取甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物100mg，溶于10mL流动相中，过滤后作为待分离样品。向高速逆流色谱仪中以20mL/min的速度泵入固定相，待管路充分充满固定相后以900rpm转动主机，同时2mL/min泵入流动相，检测波长设为285nm，待两相达到平衡，基线稳定后注入样品；60min时将螺旋管出口与流动相泵的入口连接，经过2次循环；360min时切断出口和入口本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）以麦冬须根为原料，经乙醇提取、乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析获得仅含有甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物；2）步骤1）得到的甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物应用高速逆流仪器进行分离纯化，高速逆流仪器条件为将甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物溶于上相中，以10～20mL/min 的速度向高速逆流色谱仪中泵入下相，待管路完全充满固定相后以600～1000rpm转动主机，同时以1～3mL/min的速度泵入流动相，运行一定时间后将螺旋管出口与流动相泵的入口连接，根据HSCCC分离情况，循环3～8次后，切断出口和入口的连接，从出口处收集流出物；3）步骤2）得到的流出液用HPLC进行检测，分别将甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B纯度大于98％的收集液合并，用旋转蒸发仪回收溶剂，得到单体化合物。

【技术特征摘要】
1.一种采用循环高速逆流色谱从麦冬须根中分离两种高异黄酮的方法，其特征在于包括以下工艺步骤：1）以麦冬须根为原料，经乙醇提取、乙酸乙酯萃取和硅胶柱层析获得仅含有甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物；2）步骤1）得到的甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物应用高速逆流仪器进行分离纯化，高速逆流仪器条件为将甲基麦冬黄烷酮A和甲基麦冬黄烷酮B混合物溶于下相中，以10～20mL/min的速度向高速逆流色谱仪中泵入上相，待管路完全充满固定相后以600～1000rpm转动主机，同时以1～3mL/min的速度泵入流动相，运行一定时间后将螺旋管出口与流动相泵的入口连接，根据HSCCC分离情况，循环3～8次后，切断出口和入口的连接，从出口处收集流出物，高速逆流色谱两相溶剂体系正己烷∶乙酸乙酯∶乙醇∶乙...

【专利技术属性】
技术研发人员：周一峰，王丽玲，茅则东，钟森，张苗苗，姚舜，葛青，毛建卫，
申请(专利权)人：浙江科技学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33