一种LLVV-Hemorphin-6肽的制备方法和用途技术

本发明专利技术公开了一种LLVV-Hemorphin-6肽、制备方法和用途。所述的LLVV-Hemorphin-6肽具有如下结构：可以通过具有底物专一性的蛋白酶特异性酶解血红蛋白的方法制备。本发明专利技术的LLVV-Hemorphin-6肽具有制备工艺稳定、纯度高、重现性好，与抗肿瘤5-氟尿嘧啶联合应用协同增效的特点，有望成为临床上治疗肿瘤类疾病的辅助用药。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于医药化学领域，具体设及一种LLVV-Hemo巧hin-6肤及制备方法及 用途，特别是设及通过具有底物专一性的蛋白酶特异性酶解血红蛋白的方法制备一种LLVV-Hemorphin-6肤，W及此多肤在制备抗肿瘤药物中的应用。
技术介绍
阳002] 生物活性肤度iologicalactiveP巧tides)是源于蛋白质的多功能化合物，由蛋 白质中25个天然氨基酸W不同组成和排列方式构成的从二肤到复杂的线性、环形结构的 多肤的不同肤类。生物活性肤具有设及神经、激素W及免疫调节、抗高血压、抗细菌、抗癌、 抗氧化、清除自由基和改善食品风味等功能，成为医药W及食品研究的一个热点。 动物血液是生物活性肤的来源之一，通过生物蛋白酶解技术可W将血红蛋白水解 成小分子肤。研究表明血红蛋白源生物活性肤具有一系列重要的功能活性，如阿片样活性、 ACE抑制活性、增强血管舒缓激肤活性、刺激细菌生长活性、镇痛活性、抗菌活性、W及抗氧 化活性等。阿片样活性肤（opioidpeptide) -般为含有X-Tyr-Phe、Tyr-X-X-Phe或 Tyr-X-X-Tyr的氨基酸片段的小肤，其具有吗啡样活性，在镇痛、调节人体情绪、脉搏、呼吸 和体溫等方面具有明显功能。VadimT.Ivanov和VladimirZ.Pletnev等研究发现在牛下 丘脑、小脑、海马体等部位发现了具有阿片活性小肤YPWTQ，运和血红蛋白β链33-40位的 氨基酸序列一致，因此将具有YPWTQ片段的活性肤称为化morphin肤。近年来，从血红蛋白 中提取出此种阿片活性样肤成为了科学家的研究热点。 阳0化]化mo巧bin是在血液中发现的一类天然产生的内源性阿片肤，来自于血红蛋白的β链。它通过阿片受体激活具有镇痛功能，通过对血管紧张素转换酶（ACE)的抑制作用 具有血压调节功能，此外还可W提高脑啡肤的含量。J.Μ.Piot等利用胃蛋白酶和组织蛋 白酶D处理血红蛋白，利用蛋白凝胶色谱从水解物中提取出两种具有阿片样活性的多肤， LVV-Hemo巧hin-7 (LVVYPWTQR巧和VVHemo巧hin-7 (VVYPWTQRF)。利用反向高效液相色谱 检测了胃蛋白酶水解物中两种阿片样活性肤的酶解动力学曲线，发现酶解时间不同、体系 内产生的活性多肤的结构不同，而且随着酶解时间的延长会导致已产生的活性肤被再次酶 解，造成了酶解产物的不确定性，为了得到最终的产品，只能通过凝胶色谱分离产品，但是 因为操作麻烦且产量低，无法规模化生产。 本专利技术选择具有高度底物专一性的蛋白酶，特异性酶解血红蛋白，再通过分离提 纯等方法得到结构单一的LLVV-Hemorphin-6肤，并将此多肤联合5-氣尿喀晚用于肿瘤类 疾病的治疗取得了意想不到的效果，不仅抗肿瘤活性优于两种药物单独使用，而且优于两 者的直接加合效果。本专利技术的LLVV-Hemorphin-6肤具有制备工艺稳定，纯度高，重现性好， 与抗肿瘤5-氣尿喀晚联合应用协同增效的特点，有望成为临床上治疗肿瘤类疾病的辅助 用药。
技术实现思路
阳007] 本专利技术的目的在于克服现有技术的不足，提供一种LLVV-Hemo巧hin-6肤。 本专利技术的第二个目的是提供一种LLVV-Hemo巧hin-6肤的制备方法，为此本专利技术 选用具有高度底物专一性的蛋白酶，蛋白水解过程中只在肤链的精氨酸残基的簇基端断 裂，特异性酶解血红蛋白，得到含有目标肤的蛋白水解液，通过分离提纯等方法得到结构单 一的LLVV-Hemo巧hin-6 肤。 本专利技术的第Ξ个目的是提供一种LLVV-Hemo巧hin-6肤作为抗肿瘤辅助用药的用 途。 本专利技术的目的主要通过W下技术方案实现： 一种LLVV-Hemo巧hin-6肤，具有肤链的氨基酸序列见下式： LLVV-Hemorph in-6 Leu-Leu-Val-Val-Tyr-Pro-Trp-Thr-Gln-Arg 一种LLVV-Hemorphin-6肤的制备方法是将蛋白酶溶于含有小分子琉基化合物W 及氯化巧的缓冲溶液中活化；血红蛋白溶于缓冲溶液中，浓度为1~50mg/mL;将血红蛋白 和经过活化的蛋白酶溶液W-定比例混合，4~55°C下酶解反应4~30小时，得到蛋白酶 解液；经过一系列分离方法，从蛋白酶解液中分离出目标肤。 本专利技术中所用的蛋白酶为具有底物专一性特性的蛋白酶，酶解时肤键断裂部位为 肤链上精氨酸残基的簇基端，如clostripain、hlcipain、GingipainR或树脂固定化的 clostripain酶等。本专利技术中蛋白酶的活化是在包含有小分子琉基化合物和氯化巧的缓冲 溶液中进行；酶活化时，浓度为0. 2~lOmg/mL;4~37°C活化一段时间。本专利技术中蛋白酶 解时底物蛋白浓度为1~50mg/mL，W2~25mg/mL为最佳。本专利技术中蛋白酶解时溫度为 4~55°C，W37~50°C为最佳。经过检测，本专利技术得到的LLVV-Hemo巧hin-6肤纯度在82~ 95wt%之间，得到的多肤产品分子量为1274化。 一种LLVV-Hemo巧hin-6肤在制备抗肿瘤辅助用药中的应用，特别是与5-氣尿喀 晚联用用于治疗临床上的各种肿瘤，如：肝癌、肺癌、胃癌、乳腺癌等。 本专利技术和现有技术相比具有如下突出的技术优势： (1)本专利技术得到了一种生物活性肤LLVV-Hemo巧hin-6肤，具有重要的医用价值。 (2)本专利技术采用蛋白酶酶解血红蛋白制备生物活性肤，充分开发和利用了目前利 用度低的血红蛋白样品，具有尤为重要的经济效益和社会效益 (3)与传统酶解血红蛋白方法相比，本专利技术得到的酶解小肤的分子结构确定，不会 因操作条件的变化而导致肤结构的差异，增强了产物活性肤结构的可控性。 (4)本专利技术目标肤的提取和纯化工艺简单，定向收集LLVV-Hemcxrphin-6肤片段， 多肤纯度高达95%，工艺稳定、重现性好。【附图说明】 图1为本专利技术实施例1蛋白水解液的高效液相色谱。 图2为本专利技术5-氣尿喀晚的抗肿瘤实验结果。 图3为本专利技术实施例1-8制备的LLVV-Hemo巧hin6肤的抗肿瘤实验结果。 图4为本专利技术实施例1-8制备的LLVV-Hemorphin6肤和5-氣尿喀晚联用的抗肿 瘤实验结果。【具体实施方式】 下面通过实施例对本专利技术作进一步说明，其目的仅在于更好的理解本专利技术的内容 而非限制本专利技术的保护范围： 阳0%] 实施例1 (1)蛋白酶的活化：蛋白酶clostripain3mg/mL溶于含有二硫苏糖醇和氯化巧的 Ξ径甲基氨基甲烧（Tris)缓冲溶液，4°C活化； 阳02引 似血红蛋白溶于Tris缓冲溶液中，浓度为20mg/mL，将血红蛋白和经过活化的 蛋白酶溶液混合，55°C酶解4小时；HPLC分析酶解液中组分及分子量，确定目标肤的出峰时 间，结果见图1。...

【技术保护点】
一种LLVV‑Hemorphin‑6肽，其特征是具有肽链的氨基酸序列如下：

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘天军，张燕，
申请(专利权)人：刘天军，
类型：发明
国别省市：天津;12