本发明专利技术涉及一种焦磷酸测序法检测CYP2C9基因分型的引物对及试剂盒，属于体外核酸检测技术领域。所述引物对包括CYP2C9*2及CYP2C9*3正向扩增引物、反向扩增引物及测序引物，所述CYP2C9*2正向扩增引物及所述CYP2C9*3反向扩增引物的5’端分别进行生物素标记；所述试剂盒包括扩增引物、PCR反应液1、PCR反应液2、测序引物、尿嘧啶DNA糖基化酶及Taq聚合酶。本发明专利技术提供的所述试剂盒具有检测结果准确、特异性高、检测周期短、操作简单并能有效满足临床检验要求的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及体外核酸检测
，尤其设及一种焦憐酸测序法检测CYP2C9基 因分型的引物对及试剂盒。
技术介绍
细胞色素P4502C9 (切toe虹omeP4502C9,CYP2C9)占肝微粒体细胞色素P450总量 的20%，能催化代谢许多临床常用药物，其在临床药物代谢中的重要性越来越受到重视。CYP2C9基因具有高度遗传多态性，其最常见的基因突变位点是 CYP2C9*2(rsl799853)和CYP209*3(rsl057910)，其编码的酶活性分别比野生型CYP2C9*! 降低了 30%和80%，影响其底物药物在体内的代谢，造成药物疗效和毒性的个体差异，导 致CYP2C9基因突变个体对华法林的需求剂量较低。携带运两个等位基因的个体服用华法 林后达到稳态浓度需要的时间较长，且在使用初期有较高出血危险性，因此CYP2C9巧或 CYP2C9*3基因型个体服用华发林时应减少剂量，但是等位基因突变个体长期治疗过程中 过度抗凝的危险性没有增加。其他突变体CYP2C9*4,CYP2C9*5,CYP2C9*6W及CYP2C9*11 等在人群中突变频率很低，其对华法林需求剂量的影响还有待于进一步研究。CYP2C9*2 和CYP2C9*3等位基因频率在不同种族中有较大差异，其中，在高加索人中，CYP2C9巧和 CYP2C9*3等位基因频率大约分别是8% -20%和6% -10% ;在亚洲人群中，CYP2C9巧等位 基因不存在，CYP2C9*3等位基因频率大约是1% -4% ;在美洲黑人中，CYP2C9巧等位基因 频率大约是2% -4%，CYP2C9*3等位基因频率大约是1% -2%。 华法林是一种双香豆素衍生物，是目前临床上应用最广泛的口服抗凝药物之一， 用于预防和治疗深静脉血栓、肺栓塞、屯、脏瓣膜置换术及房颤导致的血栓形成。华法林治 疗窗较窄，很小的剂量都可能导致不良反应的发生，且在不同个体达到相同作用效果，高低 剂量者之间可相差10倍W上。华法林是由S-华法林和R-华法林组成的消旋体，在体内 S-华法林反映了 60 % -70 %的抗凝活性，而R-华法林占30 % -40 %，其中S-华法林主要 由CYP2C9代谢，故CYP2C9基因多态性对华法林剂量使用有较大影响。临床研究结果显示： 达到相同抗凝效果时，CYP2C9巧和CYP2C9*3基因型患者华法林的使用剂量较野生型患者 低；此外，美国食品药品监督管理局（抑A)明确指出：在使用华法林时，建议检测CYP2C9基 因型。因此，患者CYP2C9基因型与临床用药中华法林的正确合理使用存在显著的相关性。 焦憐酸测序（Pyrosequencing)是一种基于聚合原理的DNA测序（即，确定DNA 中核巧酸的顺序）方法，属于新一代DNA序列分析技术，具备同时对大量样品进行测序分 析的能力，并具有高通量、特异性高、快速、直观及低成本的优点。其基本原理为，由4种酶 催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应，在每一轮测序反应中，只加入一种dNTP，若 该dNTP与模板配对，聚合酶就可W将其渗入到引物链中并释放出等摩尔数的焦憐酸基团 (PPi)，PPi可最终转化为可见光信号，并由PyrogramTM转化为一个峰值，每个峰值的高度 与反应中渗入的核巧酸数目成正比；然后加入下一种dNTP，继续DNA链的合成；最后通过分 析出峰值的情况，达到测定DNA序列的目的。不过，现有技术中还没有利用焦憐酸测序技术 检测CYP2C9基因分型的产品。目前，在现有技术中，尤其是在医院内，采用有"金标准"之称的PCR-直接测序法 对CYP2C9基因进行检测，但该方法的敏感性不高，只能检测出突变细胞比率在10-20% W 上的肿瘤组织及外周血，对于突变细胞比率小于10%的肿瘤组织及外周血，常规PCR-直接 测序法几乎无能为力；此外，该方法还存在成本高、检测周期长及操作繁琐的缺点。
技术实现思路
为了解决上述方法检测CYP2C9基因分型过程中存在敏感性不高、检测周期长、操 作繁琐及成本高的技术问题，本专利技术提供一种敏感性高、特异性强、检测周期短、操作简单 并有效满足临床检验要求的焦憐酸测序法检测CYP2C9基因分型的引物对及试剂盒。 本专利技术提供了一种焦憐酸测序法检测CYP2C9基因分型的引物对，所述CYP2C9基 因检测的多态性位点为CYP2C9巧和/或CYP2C9*3,所述引物对包括： (1)对于CYP2C9巧等位基因， 扩增引物为： CYP2C9巧正向扩增引物：5' -GACGCTGCGGAATTTTGG-3'（沈Q ID NO. 1); CYP2C9巧反向扩增引物： 5' -CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG-3,佛Q ID NO. 2); CYP2C9巧测序引物：5' -GGCTTCCTCTTGAACA-3'（沈Q ID NO. 3); 其中，所述CYP2C9巧正向扩增引物的5'端进行生物素标记； (2)对于CYP2C9*3等位基因， 扩增引物为：[001引CYP2C9*3正向扩增引物：5, -AGCCACATGCCCTACACAG-3'（沈Q ID NO. 4);[001引CYP2C9*3反向扩增引物：5' -CAGGCTGGTGGGGAGAAG-3'（沈Q ID NO. 5); CYP2C9*3测序引物：5' -GCACGAGGTCCAGAGA-3'（沈Q ID NO. 6); 其中，所述CYP2C9*3反向扩增引物的5'端进行生物素标记。 本专利技术还提供了一种焦憐酸测序法检测CYP2C9基因分型的试剂盒，所述CYP2C9 基因检测的多态性位点为CYP2C9巧和/或CYP2C9*3,所述试剂盒包括： (1)对于CYP2C9巧等位基因， CYP2C9巧正向扩增引物：5 ' -GACGCTGCGGAATTTTGG-3 '；PCR反应液1，所述PCR反应液1含有CYP2C9巧反向扩增引物：5' -CAGTAAGGTCAG TGATATGGAGTAGGG-3'； CYP2C9巧测序引物：5 ' -GGCTTCCTCTTGAACA-3 '； 其中，所述CYP2C9巧正向扩增引物的5'端进行生物素标记； (2)对于CYP2C9*3等位基因， CYP2C9*3反向扩增引物：5 ' -CAGGCTGGTGGGGAGAAG-3 '； PCR反应液2，所述PCR反应液2含有CYP2C9*3正向扩增引物： 5' -AGCCACATGCCCTACACAG-3'； CYP2C9*3测序引物：5' -GCACGAGGTCCAGAGA-3'；其中，所述CYP2C9*3反向扩增引物的5'端进行生物素标记。 在本专利技术提供的所述试剂盒的一种较佳实施例中，所述试剂盒还包括：CYP2C9巧阳性对照品1，其为插有SEQIDNO. 8所示核巧酸序列的CYP2C9巧野生 纯合子质粒；CYP2C9巧阳性对照品2,其为所述CYP2C9巧野生纯合子质粒与插有SEQIDNO. 9 所示核巧酸序列的CYP2C9巧突变纯合子质粒组成的质粒混合物；CYP203阳性对照品1，其为插有SEQIDNO. 10所示核巧酸序列的CYP2C9*3野生 纯合子质粒；CYP203阳性对照品2,其为所述CYP2C9*3野生纯合子本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种焦磷酸测序法检测CYP2C9基因分型的引物对，其特征在于，所述CYP2C9基因检测的多态性位点为CYP2C9*2和/或CYP2C9*3，所述引物对包括：(1)对于CYP2C9*2等位基因，扩增引物为：CYP2C9*2正向扩增引物：5’‑GACGCTGCGGAATTTTGG‑3’；CYP2C9*2反向扩增引物：5’‑CAGTAAGGTCAGTGATATGGAGTAGGG‑3’；CYP2C9*2测序引物：5’‑GGCTTCCTCTTGAACA‑3’；其中，所述CYP2C9*2正向扩增引物的5’端进行生物素标记；(2)对于CYP2C9*3等位基因，扩增引物为：CYP2C9*3正向扩增引物：5’‑AGCCACATGCCCTACACAG‑3’；CYP2C9*3反向扩增引物：5’‑CAGGCTGGTGGGGAGAAG‑3’；CYP2C9*3测序引物：5’‑GCACGAGGTCCAGAGA‑3’；其中，所述CYP2C9*3反向扩增引物的5’端进行生物素标记。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：滕祥云，黄少亚，
申请(专利权)人：长沙三济生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：湖南;43
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