一种人工合成的抗虫基因及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种人工合成的抗虫基因及其应用。本发明专利技术所提供的抗虫基因为根据玉米密码子偏好性对Cry1Ah基因进行优化后的基因，其核苷酸序列如序列表中序列3所示。与转入优化前Cry1Ah基因的转基因玉米相比，本发明专利技术所提供的人工合成的抗虫基因的转基因玉米，其Cry1Ah蛋白的表达量明显提高；同时抗虫性也明显提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术设及，特别设及一种根据玉米偏好密码 子设计并合成的抗虫基因及其应用。
技术介绍
目前在植物转基因育种中所应用的外源基因如化、EPSPS等，大多来自原核生物， 由于原核生物基因自身的特点，如DAT含量较高，超过60%，造成基因表达的mRNA在植物 体内极易被降解；2)存在类似真核基因的内含子切点、转录终止子序列，造成转录不完整、 mRNA异常剪切等；3)密码子与植物密码子存在较大差异，造成蛋白翻译效率降低；4)其结 构与植物等真核生物差异显著，如不含有真核生物基因的5' -UTR序列和3'末端的polyA 加尾序列，导致基因在植物体内往往表达水平较低。例如，来自于苏云金芽抱杆菌的野生型 杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，其表达的毒蛋白只占总蛋白的0.001%或者几乎 检测不到。 玉米惧是世界性的主要玉米害虫，每年因玉米惧危害造成玉米产量损失在5%左 右。我国是玉米惧的多发和重发区，20世纪70年代W来，几乎每两年就大发生一次，年损失 玉米380-640万吨，相当于一个中等玉米省的产量。 由于玉米的内源抗虫性是受多基因控制的，且屯、叶期祀标害虫和穗期祀标害虫基 因各自独立遗传，用常规育种方法培育抗惧杂交种不仅周期长，而且很难获得兼抗两个世 代玉米惧的亲本。同时，玉米抗惧基因很有可能与高产性状呈负相关，20年来各国抗惧育种 均未取得明显进展。
技术实现思路
阳〇化]本专利技术的一个目的是提供一种DNA分子，该DNA分子是抗虫基因。 本专利技术所提供的DNA分子，名称为mcrylAh，其核巧酸序列为序列表中序列3或序 列3的第1-2007位。 所述DNA分子的核巧酸序列还可为与序列表中序列3或序列3的第1-2007位至 少具有98%的同一性，且编码序列9所不蛋白质（命名为化ylAh蛋白）。 其中，序列3由2010个核巧酸组成，其末尾处为两个终止密码子，编码序列9所示 的化ylAh蛋白。序列9由668个氨基酸组成。 含有所述DNA分子（mcrylAh)的重组载体、重组宿主菌、重组细胞系或转基因植物 也属于本专利技术的保护范围。 根据需要，所述重组载体既可为克隆载体，也可为表达载体；在本专利技术的一个实施 例中，所述重组载体具体为PS3300-UMG2-UC2A。在本专利技术的一个实施例中，所述重组宿主菌 为携带有所述DNA分子的农杆菌，如LBA4404。所述重组细胞系可W为真核细胞，也可W为 原核细胞，如植物细胞系。所述转基因植物（如玉米）包括种子、愈伤组织、完整植株和细 胞。 由所述DM分子（mcrylAh)转录所得的RNA也属于本专利技术的保护范围。 所述DNA分子（mcrylAh)在培育抗虫转基因玉米中的应用也属于本专利技术的保护范 围。所述转基因玉米包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。 所述DNA分子（mcrylAh)在提高玉米化ylAh蛋白表达量中的应用也属于本专利技术 的保护范围。所述化ylAh蛋白为序列表中序列9所不的蛋白质。 在本专利技术的一个实施例中，所述玉米具体为玉米化II。 在本专利技术中，所述抗虫具体为抗玉米惧。 本专利技术针对原核生物抗虫基因化ylAh(序列1)在植物中表达较低的问题，在保持 原氨基酸序列不变的前提下，采用玉米偏好性密码子对其进行优化，去除影响RNA稳定性 的结构（如polyA、重复序列、AT和GC串联重复、RNA二级结构、核糖体结合位点等），增加 GC含量等，使其在玉米中高效稳定表达。 实验证实，本专利技术所提供的人工合成的抗虫基因（序列3)的转基因玉米，其 化ylAh蛋白蛋白的表达量明显提高，每克（鲜重）叶片中化ylAh蛋白的表达量可达 3. 18μg，而原始基因表达量仅为1.01μg。同时，本专利技术所提供的人工合成的抗虫基因（序 列3)的转基因玉米对祀标害虫的抗性也明显提高，转入mcrylAh基因的Te代植株，在玉米 5-6叶期接虫后，无明显的虫害，表现正常；而转crylAh基因（优化前，序列2)及非转基因 植株，在接虫后，虫害非常严重。【附图说明】图 1 为载体PS3300-UMCT-UMG2、PS3300-UMG2-UCA和PS3300-UMG2-UC2A的质粒 图谱。其中，A为PS3300-UMCT-UMG2的质粒图谱巧为PS3300-UMG2-UCA的质粒图谱；C为 PS3300-UMG2-UC2A的质粒图谱。 图2为转基因玉米CrylAh基因、mCrylAh基因和mG2-aroA基因的PCR检测图谱。 其中，A为转基因玉米化ylAh基因的PCR检测图谱；1 :〇r(质粒阳性对照）；2:Marker;3 : CK(未加DNA) ;4:CK(非转基因玉米）；5-24:转化ylAh基因玉米事件。B为转基因玉米 mCrylAh基因的PCR检测图谱；1 :αΤ(质粒阳性对照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4 : CK(非转基因玉米）；5-24:转mCrylAh基因玉米事件。C为转基因玉米mG2-aroA基因的 PCR检测图谱；1 :〇r(质粒阳性对照）；2:Marker;3:CK(未加DNA) ;4:CK(非转基因玉 米）；5-14 :转CrylAh基因玉米事件；15-24:转mCrylAh基因玉米事件。 图3为转基因玉米苗期草甘麟的耐受性检测结果。[002U 图4为转基因玉米田间抗虫性检测结果。其中，A为海南抗虫的转mCrylAh基因 玉米株系；B为海南不抗虫的非转基因对照株系。【具体实施方式】 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。 实施例1、密码子优化型抗虫基因的获得本实施例根据化ylAh全长基因（核巧酸序列如序列表中序列1所示，参见中国专 利申请：200410009918. 9)编码蛋白的前667个氨基酸序列（前667个氨基酸序列如序列 表中序列8所示，对应的核巧酸序列如序列表中序列2所示），在保证氨基酸序列不变的前 提下，首先采用玉米偏好密码子对化ylAh基因进行人工优化改造。尽量避免使用玉米稀有 密码子，并调整了密码子的使用频率（表1)。在此基础上，去除DNA序列中存在的典型的 造成植物基因转录本不稳定的富含AT序列，并去除了发夹结构，得到的新的核巧酸序列为 序列表中序列3。序列3与化ylAh基因（序列1)的l-20(nbp(即序列2)的同源性只有 70%，而G+C含量由原来的37. 4%增加到56. 3%。同时为了便于克隆，在起始密码子后添 加GGCS个核巧酸。序列3所示基因即为密码子优化型抗虫基因，将其命名为mcrylAh。密 码子在化ylAh基因和me巧lAh基因中的使用频率见表1。为方便克隆，专利技术人在序列3的 5'端引入Spel酶切位点，在3'端引入Aatll酶切位点，最终序列如序列表中序列4所示。 序列4的第7-2016位即为序列3。序列1的第1-2001位（即序列2)编码序列表中序列8 所示蛋白，序列3W及序列4的第7-2016位均编码序列9所示蛋白（与序列8所示蛋白相 比多出序列9自N端起的第2个氨基酸残基），将该蛋白命名为化ylAh蛋白。 阳0%] 表1玉米优选密码子标准 实施例2、mcrylAh转基因玉米的获得 一、重组表达载体PS3300-U本文档来自技高网...

【技术保护点】
DNA分子，为核苷酸序列如序列表中的序列3所示的DNA分子；

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：韩庚辰，张杰，姜付坤，邓德芝，钱雪娅，耿丽丽，
申请(专利权)人：北京奥瑞金种业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11