以干燥状态包被有层粘连蛋白片段的细胞培养器具制造技术

一种细胞培养器具，在要与细胞接触的表面上以干燥状态包被有具有整合素α6β1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体，该细胞培养器具的特征在于，该层粘连蛋白片段为选自层粘连蛋白α5β1γ1和层粘连蛋白α5β2γ1中的至少1种。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及细胞培养器具，详细而言涉及以干燥状态包被有具有整合素 α6β1 结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具。
技术介绍
人ES细胞、人iPS细胞等人多能干细胞在再生医疗中的应用受到全世界的注目。 为了将人多能干细胞应用于再生医疗，需要开发出将这些干细胞安全且稳定地进行培养、 扩增的培养技术。特别是在不使用饲养细胞、且不含有来自异种动物的成分的（无异源体 系）条件下的稳定培养法的开发成为了迫切的课题。 本专利技术人着眼于初期胚胎的多能干细胞将以层粘连蛋白α 5 β 1 γ 1 (层粘连蛋白 511)为主要成分的基底膜作为基点，并在世界上领先地报道了人层粘连蛋白511的重组蛋 白质作为人ES细胞的无饲养层培养基质有用（参照非专利文献1)。另外，本专利技术人报道 了，层粘连蛋白511对α 6 β 1整合素具有非常高的亲和性、以及层粘连蛋白511的E8片段 (层粘连蛋白511Ε8)具有与全长的层粘连蛋白511同等的α 6 β 1整合素结合活性（参照 非专利文献2)。另外，本专利技术人发现，以往较困难的多能干细胞的基于单一分散的传代培养 能够在层粘连蛋白511Ε8上实现，并报道了人层粘连蛋白511Ε8作为人多能干细胞的无饲 养层培养基质极其有效（参照专利文献1、非专利文献3)。 以人层粘连蛋白511Ε8为基质来培养细胞时，需要在培养器的表面预先包被人 层粘连蛋白511Ε8。在要培养人多能干细胞时，以如下的方式进行包被：以达到0. 25~ 2. 0 μ g/cm2的方式在培养器中加入人层粘连蛋白511Ε8溶液，在4°C孵育过夜、或在室温~ 37°C孵育1~3小时。但是，包被在培养器表面的层粘连蛋白或其活性片段容易由于干燥 而失活（参照非专利文献4)，实际中，本专利技术人确认到，包被于培养器表面的人层粘连蛋白 511E8在干燥后会逐渐失去活性。为了将人层粘连蛋白511E8作为人多能干细胞的培养基 质而广泛地在再生医疗等领域使用，正在寻求用于以干燥状态长期稳定地维持包被在培养 器表面的人层粘连蛋白511E8的活性的技术开发。 现有技术文献 专利文献 专利文献1 :国际公开公报第2011/043405号 非专利文献 非专利文献 I :Miyazaki T, Futaki S, Hasegawa K, Kawasaki M, Sanzen N, Hayashi Mj Kawase Ej Sekiguchi KjNakatsuji NjSuemori H. Recombinant human laminin isoforms can support the undifferentiated growth of human embryonic stem cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375:27-35, 2008. 非专利文献 2 :Taniguchi Y，Ido H，Sanzen N，Hayashi M，Sato-Nishiuchi R，Futaki S，Sekiguchi K. The C-terminal region of laminin beta chains modulates the integrin binding affinities of laminins. J Biol Chem. 284:7820-7831, 2009. 非专利文献 3 :Miyazaki T，Futaki S，Suemori H，Taniguchi Y，Yamada Mj Kawasaki Mj Hayashi M，Kumagai H，Nakatsuji N，Sekiguchi Kj Kawase E. Laminin E8fragments support efficient adhesion and expansion of dissociated human pluripotent stem cells. Nat Commun. 3, 1236. Doi:10. 1038/ncomms2231, 2012. 非专利文献 4 :Doi T，Thyboll J，Kortesmaa J，Jansson K，Iivanainen A,Parvardeh M，Timpl R，Hedin Uj Swedenborg j,Tryggvason K. Recombinant human laminin-10 ( a 5 β Iγ I) · J Biol Chem，277, 12741-12748, 2002.
技术实现思路
专利技术所要解决的课题 本专利技术的课题在于，发现用于以干燥状态长期稳定地维持能够用作人干细胞的无 饲养层培养基质的层粘连蛋白片段的活性的技术，并提供以干燥状态包被有维持了活性的 能够用作人干细胞的无饲养层培养基质的层粘连蛋白片段的细胞培养器具。 用于解决课题的方法 本专利技术为了解决上述课题，包含以下的专利技术。 -种细胞培养器具，其为在要与细胞接触的表面上以干燥状态包被有具有整 合素 α 6β 1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具，该细胞培养器具的 特征在于，该层粘连蛋白片段为选自层粘连蛋白α5β1γ1和层粘连蛋白α5β2γ1中的 至少1种的片段，该细胞培养器具为以下的（1)、⑵或（3)， (1)在要与细胞接触的表面上，以干燥状态仅包被有具有整合素a 6 β 1结合活性 的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具； (2)在要与细胞接触的表面上，以干燥状态包被有具有整合素a 6 β 1结合活性的 层粘连蛋白片段或其改造体、以及不具有整合素 a 6 β 1结合活性的层粘连蛋白片段的细 胞培养器具； (3)在要与细胞接触的表面上，以干燥状态包被有具有整合素 a 6 β 1结合活性的 层粘连蛋白片段或其改造体、以及层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的细胞培养器具。 根据上述所述的细胞培养器具，其特征在于，所述⑴中，以0.7 μ g/cm2 以上的浓度包被有具有整合素 a 6β 1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体。 根据上述所述的细胞培养器具，其特征在于，所述（2)中，包被有1. 5 μ g/ cm2以下的浓度的具有整合素 a 6 β 1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体、以及其3倍 以上的浓度的不具有整合素 a 6 β 1结合活性的层粘连蛋白片段。 根据上述所述的细胞培养器具，其特征在于，所述（3)中，包被有1. 5 μ g/ cm2以下的浓度的具有整合素 a 6 β 1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体、以及其20倍 以上的浓度的层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质。 根据上述所述的细胞培养器具，其特征在于，层粘连蛋白片段为层粘连蛋 白Ε8片段。 根据上述所述的细胞培养器具，其特征在于，不具有整合素a 6 β 1结合活 性的层粘连蛋白片段为层粘连蛋白α 2β1γ1的片段。 根据上述所述的细胞培养器具，其特征在于，层粘连蛋白或其片段以外的 蛋白质为选自由明胶、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、转铁蛋白、髓鞘碱性蛋白、乳球蛋 白、谷胱甘肽-S-转移酶和胶原蛋白组成的组中的1种以上。 根据上述~中任一项所述的细胞培养器具，其特征在于，通过在要与 细胞接触的表面上包被期本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种细胞培养器具，在要与细胞接触的表面上以干燥状态包被有具有整合素α6β1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体，该细胞培养器具的特征在于，该层粘连蛋白片段为选自层粘连蛋白α5β1γ1和层粘连蛋白α5β2γ1中的至少1种的片段，该细胞培养器具为以下的(1)、(2)或(3)，(1)在要与细胞接触的表面上，以干燥状态仅包被有具有整合素α6β1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体的细胞培养器具；(2)在要与细胞接触的表面上，以干燥状态包被有具有整合素α6β1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体、以及不具有整合素α6β1结合活性的层粘连蛋白片段的细胞培养器具；(3)在要与细胞接触的表面上，以干燥状态包被有具有整合素α6β1结合活性的层粘连蛋白片段或其改造体、以及层粘连蛋白或其片段以外的蛋白质的细胞培养器具。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：关口清俊，筒井仰，
申请(专利权)人：国立大学法人大阪大学，
类型：发明
国别省市：日本;JP