本发明专利技术公开了一种通过红豆杉植物细胞系三线技术大规模培养生产紫杉烷的方法。主要是通过红豆杉植物细胞系规模培养两线体系G-P中，插入中间阶段的细胞线M，进行有序、平稳过渡，能兼顾细胞继代生长和次级代谢产物的调控生产两个阶段的不同工艺要求。本发明专利技术与现有方案所不同的关键点在于：在植物细胞继代线G之后，不是立刻进行调控诱导生产，而是先进行细胞状态调整，包括培养基组分的部分改变、抗褐变剂的添加，激素比例改变来调整细胞团的大小和致密度，并控制细胞周期，通过这个短期过渡线M，再转入终端的调控生产线P。最终获得了高产和稳产的兼顾。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物细胞大规模培养生产有用小分子次级代谢产物的
，具体涉及采用G-M-P三线技术，通过红豆杉细胞规模培养生产紫杉醇、10DAB和云南紫杉烷Tc的方法。
技术介绍
紫杉醇(Paclitaxel，CAS N0.: 33069-62-4，早期和商品名为Taxol)是从红豆杉属植物(Taxus.L)的树皮和枝叶中分离出来的对卵巢癌和乳腺癌有特殊疗效的抗肿瘤药物。有限的红豆杉属植物资源使得紫杉醇成为一种比较昂贵的药物，并影响到它在临床上长期、广泛的应用。多年来，人们一直在致力于寻找解决紫杉醇药源的新途径。紫杉醇化学全合成虽然早已成功，但合成路线长，产率低，成本高，不能商业化生产。半合成是目前临床应用紫杉醇的主要来源，半合成的前体为由红豆杉枝叶中分离得到的 Baccatin III (巴卡亭 III，本专利中简写为 BAT III，CAS N0.: 27548-93-2)或10-Deacetylbaccatin III(10 一去乙醜基巴卡亭 III，本专利中简写为 10DAB，CAS N0.:32981-86-5，极少用92999_93_4)等，但依然远远满足不了临床及实验的需要。红豆杉属植物的组织与细胞培养，生产紫杉醇，以及生产重要中间体10DAB，BAT III等被认为是一种有潜力的方法之一而受到人们的重视。在努力拓展紫杉醇的药源并提高紫杉醇产量的同时，科学家亦投身到紫杉烷类化合物的研究中，期望找到抗癌活性更好的紫杉烷类化合物或者找到合适的先导化合物。已经有几百种紫杉烷从紫杉原植物或细胞培养液中分离出来。其中云南紫杉烷Tc(Taxuyunnanine C，不是Taxol C)是一种具有类神经生长因子(NGF)活性的化合物，能够强化NGF的作用，有利于老年痴呆症(Alzheimer’s disease)的治疗。Tc与紫杉醇同属于三环二萜类化合物。红豆杉植物细胞培养生产紫杉醇及其中间体的工艺体系中，见图1，目前普遍使用两线(细胞生长G-次级代谢产物生产P两阶段)培养技术体系，见图2。在此体系下，高产下的稳产非常困难。主要原因在于次级代谢与初级代谢非常不同，次级代谢产物不是植物细胞生长所必须的，所以要经过诱导、刺激，感受环境的压力后，才能产生，而且其产生和产量都受到多级的调控，包括短期的正反馈和长期的负反馈，生产具有极大的不确定性。尤其是植物细胞的长期继代中，由于对环境的不断适应，基因组虽然变化不大，但表观遗传越来越不利于次级代谢的生产。对于工业化，植物细胞的继代生长和次级代谢产物的调控生产有不同的工艺要求，比如，继代生长要求细胞的生物量越大越好，与初级代谢无关的基因最好都是关闭的、沉没的，染色体区域被异染色质化，涉及组蛋白甲基化、去乙酰化、乙酰化，DNA的甲基化修饰，甲基化修饰组蛋白结合蛋白Sir2/3/4，甲基化DNA结合蛋白，非编码RNA等等在内的一系列复杂组分的生理反应过程。基因沉寂导致相应区段内的遗传信息不能被转录。而次级代谢产物的调控生产，却要求在主动刺激植物细胞后，植物细胞的次级代谢基因组能迅速开放，而初级代谢的基因组最好得到抑制，但又不能引起细胞的过度的凋亡和死亡。大部分的次级代谢产物，对于植物宿主细胞来说，是加重了代谢流的负担，而且许多次级代谢产物对于宿主细胞本身也有毒性。比如，紫杉醇，就是通过促进微管蛋白聚合抑制解聚，保持微管蛋白稳定，抑制细胞有丝分裂。这对同属于真核生物的红豆杉植物细胞来说也是具有毒性的，抑制红豆杉植物细胞的分裂，引起细胞凋亡。因此，植物细胞的两个阶段的代谢流控制是非常对立的，转化阶段控制不好，很容易产生两个效果:一是调控诱导无效，植物细胞继续大量扩增，次级代谢产物极低从而没有商业生产价值，收获的是外观极佳的细胞团；二是调控过头，植物细胞大量变红、褐化、死亡，次级代谢刚开始，细胞就死亡了，收获的是没有高产量的红褐色的培养液。因此，两线技术非常难以满足有用次生代谢产物的生产。
技术实现思路
为克服现有技术存在的缺点与不足，本专利技术公开了一种采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的方法，其特征在于按如下的步骤进行: (1)构建南方红豆杉细胞系的继代线，简称为G线，接种的细胞鲜重为100g/L，接种100%新鲜膜过滤的B5培养基，继代生长周期为14天，在500mL摇瓶阶段，新鲜B5的装液量为20% ;在反应器中全培养液的装液量为10~20% 个周期中细胞鲜重的倍增为2~4倍，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的B5基础培养基指的是:生长素为2，4-D，含量10mg/L，分裂素为6-BA，含量为lmg/L，蔗糖浓度为15g/L ； (2)构建红豆杉细胞系的一条过渡线，简称Μ线，其方法是，Μ线第1代种子来源于G线，其后代的种子都是来源于上一代的Μ线，一直持续到2~7代，接种的新鲜基础培养基为Β5，但只加50%的磷酸盐，即使用浓度0.85g/L ;另外还添加了谷氨酰胺GLN 2mg/L，调整蔗糖浓度为25g/L，并进行磷酸盐饥饿法进行细胞周期同步化培养，每代Ml线的细胞进行固定调控策略，甲基茉莉酸100 μ M、硫代硫酸银10mM的跟踪，其磷酸盐饥饿法的步骤:在每代次的第7天、第10天和点12天分别加入20%、20%和10%的磷酸盐，在摇瓶培养转速为100~120rpm,或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的植物激素指的是，最终使用浓度的生长素为NAA 40mg/L，分裂素6_BA 2mg/L ; (3)构建红豆杉细胞系的一条生产线，简称P线，其方法是，Μ线的红豆杉植物细胞团作为Ρ线的种子，每个Μ代次的反应器都对应一个Ρ线上的一个反应器，Ρ线上的反应器都是使用MS基础培养基，调整植物激素配比和含量，最终使用浓度，生长素为NAA 10~30mg/L,分裂素为6-BA l~10mg/L ;调整蔗糖浓度为25~60 g/L，接种时，MS基础培养基占50%的体积，原Μ线上培养14天的条件培养基及培养物占50%体积。接种的生物量为160~300g/L，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；在培养第0-10天加入茉莉酸甲酯50-300 μ M，在第5~30天加入XAD-7性大孔树脂5_200g/L，在第7、11、15和21天进行补料培养，所补料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基础培养基的大量元素和茉莉酸甲酯l~100mM组成，从第10天开始补料，一直补料到第30天，补料的速率是每天补加培养起始体积的0.5%。第30天可以收获，进行紫杉烷的分离和纯化。本专利技术所用的种子系为高产紫杉醇的南方红豆杉细胞系CGMCC n0.10002，高产10DAB的南方红豆杉细胞系CGMCC n0.10001，高产云南紫杉烷Tc的南方红豆杉细胞系TA-2。本专利技术进一步公开了采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷方法在制备提高生产紫杉醇批次稳定性方面的应用。所使用的容器，包括一般性的摇瓶，也包括特指的反应器，尤其特指中国专利的一次性反应器(ZL 201210021722.6)。提高生产紫杉醇批次稳定性指的是:紫杉醇高产在100mg/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种采用三线技术通过红豆杉植物细胞培养生产紫杉烷的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）构建南方红豆杉细胞系的继代线，简称为G线，接种的细胞鲜重为100g/L，接种100%新鲜的膜过滤B5培养基，继代生长周期为14天，在500mL摇瓶阶段，新鲜B5的装液量为20%；在反应器中全培养液的装液量为10~20%；一个周期中细胞鲜重的倍增为2~4倍，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的B5基础培养基指的是：生长素为2,4‑D，含量10mg/L，分裂素为6‑BA，含量为1mg/L，蔗糖浓度为15g/L；（2）构建红豆杉细胞系的一条过渡线，简称M线，其方法是，M线第1代种子来源于G线的一个代次，其后代的种子都是来源于上一代的M线，一直持续到2~7代，接种的新鲜基础培养基为B5，但只加50%的磷酸盐，使用浓度0.85g/L，另调整植物激素配比和含量；另外还添加了谷氨酰胺GLN 2mg/L，调整蔗糖浓度为25g/L，并进行磷酸盐饥饿法进行细胞周期同步化培养，每代M1线的细胞进行固定调控策略，甲基茉莉酸100μM、硫代硫酸银10mM的跟踪，其磷酸盐饥饿法的步骤：在每代次的第7天、第10天和点12天分别加入20%、20%和10%的磷酸盐，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；所述的植物激素指的是生长素为NAA 40mg/L，分裂素6‑BA 2mg/L；（3）构建红豆杉细胞系的一条生产线，简称P线，其方法是，M线的红豆杉植物细胞团作为P线的种子，每个M代次的反应器都对应一个P线上的一个反应器，P线上的反应器都是使用MS基础培养基，调整植物激素配比和含量，最终使用浓度，生长素为NAA 10~30mg/L，分裂素为6‑BA 1~10mg/L；调整蔗糖浓度为25~60 g/L，接种时，MS基础培养基占50%的体积，原M线上培养14天的条件培养基及培养物占50%体积；接种的生物量为160~300g/L，在摇瓶培养转速为100~120rpm，或在反应器上振荡频率为12~16rpm，避光培养；在培养第0~10天加入茉莉酸甲酯50‑300μM，在第5~30天加入XAD‑7性大孔树脂5‑200g/L，在第7、11、15和21天进行补料培养，所补料液由蔗糖500g/L，谷氨酰胺200mM，MS基础培养基的大量元素和茉莉酸甲酯1~100mM组成，从第10天开始补料，一直补料到第30天，补料的速率是每天补加培养起始体积的0.5%；第30天可以收获，进行紫杉烷的分离和纯化。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：丁靖志，王海燕，张卫，
申请(专利权)人：天津艾赛博生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：天津;12
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。