一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，包括从人尿液样品中获得尿源性细胞，对得到的原代细胞进行体外小分子诱导和培养获得贴壁生长的P1代hUSCs克隆，挑取生长状态良好的hUSCs克隆进行接种，并继续传代培养，获得细胞呈现长梭形，状态良好的hUSCs。采用本方法制备的hUSCs经诱导可定向分化为成骨细胞、脂肪细胞、骨骼肌细胞、神经细胞、成纤维细胞或平滑肌细胞，对糖尿病下肢缺血模型进行体内移植hUSCs，研究结果表明其能显著增强缺血部位的血流恢复和血管新生。本方法制备的hUSCs可应用于治疗和修复糖尿病及并发症、心脑肾血管疾病、阿尔兹海默症、骨质疏松、关节炎等病变组织与器官的修复，以及泌尿系统肿瘤预警与细胞药物的筛选。

【技术实现步骤摘要】
一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法
本专利技术涉及一种多潜能干细胞的制备方法，特别涉及一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞(HumanUrine-DerivedStemCells，hUSCs)的方法。本专利技术属于细胞生物学
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技术介绍
组织、器官的丧失或功能障碍是人类健康所面临的主要危害之一，也是人类疾病和死亡的最主要原因。据美国的一份资料显示，每年有数以百万计的美国人患有各种组织、器官的丧失或功能障碍，每年需进行800万次手术进行修复，年住院日在4000—9000万之间，年耗资超过400亿美元。近年来，干细胞领域所取得的一系列重大突破燃起了人类寻找组织器官再生修复的希望。干细胞是一类具有自我更新、高度增殖和多向分化潜能的细胞。在胚胎和成年组织中均存在着具有高度更新能力和多向分化潜能的干细胞，可分为胚胎干细胞和成体干细胞两大类。目前发现的成体干细胞主要有造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、肝脏干细胞、肌肉干细胞、皮肤干细胞、肠上皮干细胞、视网膜干细胞等。随着对干细胞可塑性认识的深入，其在多组织器官损伤性疾病治疗中的应用潜能进一步加大。与胚胎干细胞不同，成体干细胞不存在胚胎干细胞有的移植排斥反应、致瘤性及伦理等问题。在体外理想的培养条件下，将人体多种组织来源的成体干细胞从组织中提取分离出来，并在体外人工增殖扩增至治疗剂量，经合适途径移植给受者，通过参与受者组织细胞的替代和再生，修复病变或衰老的器官组织结构并重建功能，从而用于治疗多种目前尚不能用传统治疗手段治愈的相关疾病：糖尿病及并发症、心脑肾血管疾病、阿尔兹海默症、骨质疏松、关节炎等。从目前完成的干细胞临床试验表明，成体干细胞移植在安全性、有效性、稳定性等各方面均非常适合临床治疗的要求，将是未来相当一段时期内有希望首先从实验室研究真正走向临床应用的治疗性干细胞。能够利用病人自身的干细胞用于治疗具有不发生诱导免疫反应或排斥的优势，然而，因为组织特异性的干细胞数量稀少，所以很难将它们从器官和组织中分离出来。近来已有研究利用小分子化合物成功诱导多潜能干细胞定向分化，包括5-氮杂胞苷(5-aza-2–deoxycytidine5-AZA)，DNA甲基化化酶抑制剂以及作为S-腺苷同型半胱氨酸水解酶(S-adenosylhomocysteinehydrolase)竞争性抑制剂的腺苷类似物；研究还发现通过在培养过程中添加维生素C可使诱导多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcells，iPScells)的诱导效率提高10倍。目前国内关于hUSCs的研究基本处于空白阶段，本专利技术利用一种非侵入式的简单低成本的方法而非外科手术，通过体外化学小分子组合诱导重编程培养获得尿液源性多潜能干细胞。通过体外增殖培养并证实这些干细胞具有多潜能性，并且通过细胞移植发现这些hUSCs能有效促进糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生与血流恢复。此外，在植入体内后未观测到肿瘤形成，其安全性与有效性hUSCs可转化于未来临床应用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法以及由该方法得到的尿源性多潜能干细胞，研究发现这些干细胞具有多潜能性，并且通过细胞移植发现这些hUSCs能有效促进糖尿病大鼠缺血下肢的血管新生与血流恢复。为了达到以上目的，本专利技术采用了以下技术手段：本专利技术的一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)尿源性细胞的分离将获取的人尿液样品进行离心，沉淀用PBS洗1-3遍后，离心，弃上清，用培养液重悬细胞，得到尿源性细胞；(2)尿源性细胞的原代培养将得到的尿源性细胞接种于含有培养液的24孔板中，置于细胞培养箱内培养，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的P0代圆形细胞；(3)化学小分子诱导重编程获得P1代尿源性多潜能干细胞选择步骤(2)培养的得到的状态佳的细胞接种于含有培养液的六孔板中，细胞贴壁生长后，采用两步诱导法，第一步，向培养液中添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)诱导培养1-3天；第二步，向含有5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷的培养液中添加3-DeazaneplanocinA(DZNeP)以及维生素C进行诱导，每4天换一次诱导培养液，10-14天完成化学小分子诱导细胞重编程，获得贴壁生长的圆形或短梭形且具有无限增殖和多向分化潜能的细胞，即为P1代尿源性多潜能干细胞克隆；其中，5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)、3-DeazaneplanocinA(DZNeP)以及维生素C的化学结构式分别如下所示：(4)P0代尿源性多潜能干细胞的传代培养挑选小分子诱导获得的P1代尿源性多潜能干细胞克隆，接种转移至含有培养液的6孔板中继续培养，细胞生长至90％融合转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行传代培养，通过连续传代之后，获得呈现长梭形，状态良好的细胞，即为尿源性多潜能干细胞。在本专利技术所述的方法中，优选的，步骤(1)中所述的培养液为含有15％(v/v)胎牛血清(FBS)的KSFM培养液(keratinocyteserum-freemedium)。在本专利技术所述的方法中，优选的，步骤(2)中所述的培养液为含有10％(v/v)胎牛血清(FBS)、100U/ml青霉素以及100mg/ml链霉素的KSFM培养液。在本专利技术所述的方法中，优选的，步骤(2)中将得到的细胞按照500个细胞/孔的密度接种于24孔板中，置于37℃，5％CO2及饱和湿度细胞培养箱内培养，接种24h后，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的圆形细胞。在本专利技术所述的方法中，优选的，步骤(3)中所述的培养液为含有5％(v/v)FBS的KSFM以及EFM(embryonicfibroblastmedium)按照等体积混合的培养液，所述的诱导培养液为含有3-DeazaneplanocinA(DZNeP)、维生素C以及5％(v/v)FBS的KSFM以及EFM(embryonicfibroblastmedium)按照等体积混合的培养液。在本专利技术所述的方法中，优选的，步骤(3)中添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷使其终浓度达到2-10μmol/L，添加3-DeazaneplanocinA(DZNeP)以及维生素C使其终浓度分别达到1-5μmol/L以及10-40μg/ml。在本专利技术所述的方法中，步骤(4)中初次传代时间为6-8天，初次传代后，按照1：3的比例转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行传代培养，3-4天传代一次，通过连续传代5-7代之后，获得呈现长梭形，状态良好的细胞，即为尿源性多潜能干细胞，其中所述培养液为含有5％(v/v)FBS的KSFM以及EFM按照等体积混合的培养液。进一步的，本专利技术还提出了由所述的方法制备得到的尿源性多潜能干细胞，其特征在于，所述的尿源性多潜能干细胞为表达间质标志CD29、CD44、CD73、CD90和SSEA-4，不表达成熟造血细胞标志CD45及内皮标志CD31和CD133的多潜能干细胞。碱性磷酸酶(al-kalinephosphatase，ALP)染色和VonKossa矿化染色鉴定其能向成骨细胞分化；油红本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)尿源性细胞的分离将获取的人尿液样品进行离心，沉淀用PBS洗1‑3遍后，离心，弃上清，用培养液重悬细胞，得到尿源性细胞；(2)尿源性细胞的原代培养将得到的尿源性细胞接种于含有培养液的24孔板中，置于细胞培养箱内培养，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的P0代圆形细胞；(3)化学小分子诱导重编程获得P1代尿源性多潜能干细胞选择步骤(2)培养的得到的状态佳的细胞接种于含有培养液的六孔板中，细胞贴壁生长后，采用两步诱导法，第一步，向培养液中添加5‑氮杂‑2'‑脱氧胞嘧啶核苷(5‑AZA)诱导培养1‑3天；第二步，向含有5‑氮杂‑2'‑脱氧胞嘧啶核苷的培养液中添加3‑Deazaneplanocin A(DZNeP)以及维生素C进行诱导，每4天换一次诱导培养液，10‑14天完成化学小分子诱导细胞重编程，获得贴壁生长的圆形或短梭形且具有无限增殖和多向分化潜能的细胞，即为P1代尿源性多潜能干细胞克隆；(4)P0代尿源性多潜能干细胞的传代培养挑选小分子诱导获得的P1代尿源性多潜能干细胞克隆，接种转移至含有培养液的6孔板中继续培养，细胞生长至90％融合转移至含有相同培养液的9cm平皿中进行传代培养，通过连续传代之后，获得呈现长梭形，状态良好的细胞，即为尿源性多潜能干细胞。...

【技术特征摘要】
1.一种通过体外小分子诱导培养尿源性多潜能干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)尿源性细胞的分离将获取的人尿液样品进行离心，沉淀用PBS洗1-3遍后，离心，弃上清，用培养液重悬细胞，得到尿源性细胞；(2)尿源性细胞的原代培养将得到的尿源性细胞接种于含有培养液的24孔板中，置于细胞培养箱内培养，洗弃未贴壁的细胞，更换新的培养液继续培养贴壁细胞，获得贴壁生长的P0代圆形细胞；其中，所述的培养液为含有10％FBS、100U/ml青霉素以及100mg/ml链霉素的KSFM培养液；(3)化学小分子诱导重编程获得P1代尿源性多潜能干细胞选择步骤(2)培养得到的状态佳的细胞接种于含有培养液的六孔板中，细胞贴壁生长后，采用两步诱导法，第一步，向培养液中添加5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷(5-AZA)诱导培养1-3天；第二步，向含有5-氮杂-2'-脱氧胞嘧啶核苷的培养液中添加3-DeazaneplanocinA(DZNeP)以及维生素C进行诱导，每4天换一次诱导培养液，10-14天完成化学小分子诱导细胞重编程，获得贴壁生长的圆形或短梭形且具有无限增殖和多向分化潜能的细胞，即为P1代尿源性多潜能干细胞克隆；其中，所述的培养液为含有5％FBS的KSFM以及EFM按照等体积混合的培养液，所述的诱导培养液为含有3-DeazaneplanocinA(DZNeP)、维生素C以及5％FBS的...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾强，陈海旭，杨超，
申请(专利权)人：中国人民解放军总医院，
类型：发明
国别省市：北京;11