一种家鸽Cathelicidin—Cl‑CATH2肽及其基因、应用制造技术

一种家鸽Cathelicidin—Cl‑CATH2肽及其基因、应用，属于生物医学技术领域。该肽全序列为：亮‑异亮‑谷氨酰胺‑精‑甘‑精‑苯丙‑甘‑精‑苯丙‑亮‑甘‑精‑异亮‑精‑精‑苯丙‑精‑脯‑精‑异亮‑天冬酰胺‑苯丙‑天冬‑异亮‑精‑丙‑精‑甘‑丝‑异亮‑精‑亮‑甘。其基因由471个核苷酸组成，其中编码成熟肽部分的为第367‑468位核苷酸。RT‑PCR显示Cl‑CATH2对细菌脂多糖（LPS）诱导的关键致炎因子及诱导型NO合酶基因的表达均具有明显的抑制作用。蛋白水平上，Cl‑CATH2对LPS诱导的致炎因子也具有显著的负调控作用。另外，Cl‑CATH2结构简单，不含有二硫键及环状结构，方便化学合成及基因工程制备，并且它对正常细胞的细胞毒性和溶血活性都很低，能够在制备抗炎症药物中应用。

【技术实现步骤摘要】
一种家鸽Cathelicidin—Cl-CATH2肽及其基因、应用
本专利技术涉及一种家鸽Cathelicidin—Cl-CATH2肽及其基因、在制备抗炎症药物中的应用，属于生物医学

技术介绍
Cathelicidin在几乎所有种类的脊椎动物体内均有发现,在动物先天免疫系统中发挥极其重要的作用。Cathelicidin具有广谱的抗菌性，不仅对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、某些真菌以及病毒具有非常强的杀菌活性，而且对许多临床耐药菌也具有同样的作用。此外，cathelicidin还对多种免疫细胞具有趋化作用、刺激肥大细胞释放组织胺、调节巨噬细胞转录、抑制致炎因子分泌，刺激抑炎因子分泌、诱导血管生成、促进伤口愈合、诱导肿瘤细胞凋亡等多种生物学功能。由于cathelicidin具有如此众多的生物学功能，且对高等动物正常细胞几乎没有毒害能力，因此cathelicidin一直是我们研究的热点。Cathelicidin在生物制药领域具有很广阔的应用前景。此外，cathelicidin与某些疾病的发病密切相关。最近研究表明，人源cathelicidin，LL-37在人类自身免疫性皮肤病-牛皮癣的发病过程中发挥了重要的作用。LL-37能够与人自身DNA结合形成DNA-LL-37复合物，该复合物不会被正常人的免疫系统所识别，但是却能够被牛皮癣患者免疫系统识别并诱导浆细胞样树突状细胞产生大量IFN-α，而IFN-α的产生加重了牛皮癣的症状。除此之外，类风湿性关节炎和系统性红斑狼疮患者体内也检测到LL-37表达量异常升高，提示LL-37与这些疾病的发生也存在某种关系。随着cathelicidin与疾病发病机制相互关系的研究的深入，我们将对许多疾病有全新的认识，从而为疾病的治疗提供全新的思路和方法。目前cathelicidin家族小肽在医学上的应用取得了一些令人满意的成果，已经有一些相关药物进入临床研究。例如，MX-226（CPI-226）是一个从牛体内克隆得到的cathelicidin—indolicidin的衍生物，已完成IIIb期临床试验，可用于局部阻止或降低中心静脉导管相关的血液感染，显示了良好的应用前景。来源与猪的Iseganan(IB-367)，是猪cathelicidin—protegrin-1的改造体，由17个氨基酸残基组成，分子内含有2对二硫键。化疗患者口腔黏膜炎，已进入临床III期。此外，一些用于伤口愈合，抑制内毒素感染，抑制肿瘤等的抗菌肽也进入临床试验阶段。
技术实现思路
为了能更好的拓展cathelicidin在制药领域的应用，本专利技术提供一种家鸽cathelicidin—Cl-CATH2肽及其基因，以利用cathelicidin对机体或正常细胞的溶血活性和细胞毒性小；结构简单，没有二硫键和环状结构，易于化学合成的特点，将其应用于制备抗炎症药物中。本专利技术的技术方案是：一种家鸽（Columbalivia）cathelicidin—Cl-CATH2肽，所述Cl-CATH2肽是由家鸽cathelicidin基因编码的一种直链多肽，富含碱性氨基酸，Cl-CATH2肽的全序列为：亮氨酸-异亮氨酸-谷氨酰胺-精氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-亮氨酸-甘氨酸-精氨酸-异亮氨酸-精氨酸-精氨酸-苯丙氨酸-精氨酸-脯氨酸-精氨酸-异亮氨酸-天冬酰胺-苯丙氨酸-天冬氨酸-异亮氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-甘氨酸-丝氨酸-异亮氨酸-精氨酸-亮氨酸-甘氨酸。编码Cl-CATH2肽的基因由471个核苷酸组成，自5’端至3’端序列为：1ATGGCGGGGTGCTGGGTGCTGGTGCTGGCGCTGCTGGGGGGGGCCTGCGCCCTCCCGGCC61CCCCTGGCCTACACCCAGGCGCTGGCTCAGGCCGTCGACTCCTACAACCAGCGCCCCGAG121GTGCCCAACGCCTTCCGGCTGCTCAGCGCCGACCCCGAGCCCGCCCCGGGCGTCGAGCTG181AGCTCCCTGCGGCTCCTCAACTTCACCATGATGGAGACCGAGTGCACCCCGAGCGCCCGC241GTGAACCCCGATGACTGCGACTTCAAGGAGAACGGGGTCATCAAGGAGTGCTCGGGCCCG301GTGCAGTTTGGGCAGAGCTCCCCCGAGATCGACCTGCACTGCACCGACGCCTCCTCTGAT361CCGGTTCTCATCCAGCGTGGCCGGTTCGGGCGCTTCCTGGGCAGAATCCGGCGCTTTCGG421CCCCGAATCAACTTCGACATCCGCGCCCGGGGCTCCATTCGCCTGGGCTGA编码Cl-CATH2肽的成熟肽位于第367-468位核苷酸，编码34个氨基酸残基，其成熟肽氨基酸序列为：Leu1Ile2Gln3Arg4Gly5Arg6Phe7Gly8Arg9Phe10Leu11Gly12Arg13Ile14Arg15Arg16Phe17Arg18Pro19Arg20Ile21Gln22Phe23Glu24Ile25Arg26Ala27Arg28Gly29Ser30Ile31Arg32Leu33Gly34。所述家鸽（Columbalivia）cathelicidin—Cl-CATH2肽应用于制备抗炎症的治疗药物。所述Cl-CATH2肽应用于制备抗炎症的治疗药物。据所述编码Cl-CATH2肽的基因编码合成的Cl-CATH2肽溶于灭菌超纯水，用于药理活性检测。1.Cl-CATH2肽的基因克隆：家鸽脾脏总RNA提取，mRNA纯化，mRNA反转录及cDNA文库构建，根据已报道的鸟类Cathelicidin序列设计特异引物，利用半巢式PCR的方法筛选Cl-CATH2基因。cDNA第一链合成引物为Clontech公司In-FusionRSMARTerTMPCRcDNAsynthesisKit中提供的SMARTTMIVOligonucleotide引物（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGGCCATTACGGCCGGG-3’）和CDSIII/3’PCR引物（5’-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATGT(30)N−1N-3’）；cDNA第二链合成引物为（5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3’）和CDSIII⁄3’PCR引物。半巢式PCR两步的5’引物分别为：P1(5’-ATGGCGAGCTGCTGGGCTGCT-3’)和P2(5’-AACGCCTTCCAGGCTGCTCAG-3’)，另一端引物均为建库试剂盒里提供的CDSIII⁄3’PCR引物。所获阳性单克隆进行基因核苷酸序列测定，测序结果表明Cl-CATH2的基因序列由471个核苷酸组成，自5’端到3’端序列为：1ATGGCGGGGTGCTGGGTGCTGGTGCTGGCGCTGCTGGGGGGGGCCTGCGCCCTCCCGGCC61CCCCTGGCCTACACCCAGGCGCTGGCTCAGGCCGTCGACTCCTACAACCAGCGCCCCGAG121GTGCCCAACGCCTTCC本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种家鸽（Columba livia ）Cathelicidin—Cl‑CATH2肽，其特征在于：所述Cl‑CATH2肽是由家鸽Cathelicidin基因编码的一种直链多肽，富含碱性氨基酸，Cl‑CATH2肽的全序列为：亮氨酸‑异亮氨酸‑谷氨酰胺‑精氨酸‑甘氨酸‑精氨酸‑苯丙氨酸‑甘氨酸‑精氨酸‑苯丙氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸‑精氨酸‑异亮氨酸‑精氨酸‑精氨酸‑苯丙氨酸‑精氨酸‑脯氨酸‑精氨酸‑异亮氨酸‑天冬酰胺‑苯丙氨酸‑天冬氨酸‑异亮氨酸‑精氨酸‑丙氨酸‑精氨酸‑甘氨酸‑丝氨酸‑异亮氨酸‑精氨酸‑亮氨酸‑甘氨酸。

【技术特征摘要】
1.一种家鸽Cathelicidin—Cl-CATH2肽的应用，其特征在于：Cl-CATH2肽在基因及蛋白水平上通过抑制细菌脂多糖诱导的致炎因子：IL-1β，TNF-α，IL-6，NO的生成应用于制备抗炎症的治疗药物；（1）小鼠巨噬细胞RAW264.7用含有10%胎牛血清的DMEM培养基在37˚C的CO2培养箱中培养，待细胞长到状态良好的对数生长期时，用胰酶消化，弃去胰酶，用胎牛血清的DMEM培养基吹下贴壁细胞；吹打均匀后细胞计数，将细胞浓度调整到1x106/ml；（2）将吹打均匀的细胞加入到24孔板中，每孔1ml，在37˚C的CO2培养箱中培养过夜使细胞贴壁，然后吸出上层清液弃去，加入960ul新鲜的含有10%胎牛血清的DMEM培养基，向阳性对照组和加药组加入20ul的LPS，再加入20u...

【专利技术属性】
技术研发人员：于海宁，王义鹏，鲁一灵，卫林，
申请(专利权)人：大连理工大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21