本文提供了效应子功能缺少或高度降低但在N297处缺少糖基化时仍具高稳定性的变体人IgG1 Fe分子。此外，本文提供在哺乳动物细胞中表达时被糖基化的接头肽。IL-2结合三种跨膜受体亚单位：IL-2R-和IL-2Ry，两者在IL-2结合时一起活化细胞内信号传导事件；以及CD25(IL-2Ra)，其用来稳定IL-2和IL-2RBY之间的相互作用。IL-2RBY递送的信号包括PI3-激酶、Ras-MAP-激酶和STAT5途径的那些信号。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】【专利说明】含有非糖基化Fc的多肽 相关申请的交叉引用 本申请要求2013年3月14日提交的美国临时申请序列第61/784, 669号的权益。 上述申请以引用方式并入本文中。序列表的引用本申请随电子格式的序列表一起提交。序列表以文本文件提供，名称为 A-1892-W0-PCT_ST25.txt，创建于2014年3月13日，大小为57,344个字节。电子格式序 列表中的信息据此全部以引用方式并入本文。背景 IL-2结合三种跨膜受体亚单位：IL-2R β和IL-2R γ，两者在IL-2结合时一起活 化细胞内信号传导事件；以及⑶25(IL-2Ra)，其用来稳定IL-2和IL-2R0 γ之间的相互 作用。IL-2Rf3 γ递送的信号包括ΡΙ3激酶、Ras-MAP激酶和STAT5途径的那些信号。 T细胞需要表达⑶25来响应通常存在于组织中的低浓度IL-2。表达⑶25的T细 胞包括抑制自体免疫炎症所必需的F0XP3+调节T细胞（Treg细胞）以及被活化来表达CD25 的F0XP3-T细胞两者。F0XP3-⑶25+T效应细胞（Teff)可为⑶4+或⑶8+细胞，两者均可促 成炎症、自体免疫、器官移植排斥或移植物抗宿主疾病。IL-2刺激的STAT5信号传导对于正 常T-reg细胞的生长和存活以及F0XP3高表达至关重要。在共同拥有的W0 2010/085495中，我们描述了用IL-2突变蛋白来优先扩增或者 刺激Treg细胞。当施用给受试者时，Treg细胞的效应可用于治疗炎性疾病和自体免疫疾 病。尽管其中所述的IL-2突变蛋白可用于在体内相比于Treg细胞优先扩增Teff细胞，但 期望产生对人治疗剂而言具有最佳属性的IL-2突变蛋白。概述本文描述的是IL-2突变蛋白，其适于高产率生产性并具有优化的药理学活性。在 尝试生产示例性IL-2突变蛋白基人治疗剂的过程中，出现多个出乎意料且不可预见的观 察结果。本文所述的IL-2突变蛋白是所述尝试的结果。 本文所述的IL-2突变蛋白对IL-2具有最小数量的改变，从而减少了产生抗IL-2 突变蛋白和/或内源性IL-2的免疫应答的可能性，但仍维持Treg的优先扩增和活化。此 外，在某些实施方案中，当施用给受试者时，IL-2突变蛋白与增加血清半衰期的分子（例如 抗体Fc)融合。IL-2突变蛋白具有短的血清半衰期（对于皮下注射为3至5小时）。本文 所述的示例性IL-2突变蛋白Fc融合物在人体内的半衰期为至少1天、至少3天、至少5天、 至少10天、至少15天、至少20天或至少25天。对IL-2突变蛋白的药代动力学的这种效 应允许IL-2突变蛋白治疗剂可以降低或较低的频率给药。 此外，在产生药物大分子时，必须考虑大量产生大分子的能力，使聚集最小化并且 使分子的稳定性最大化。IL-2突变蛋白Fc融合分子展示出此类属性。另外，在某些实施方案中，IL-2突变蛋白Fc融合蛋白含有IgGIFc区。当期望消除 IgGl (例如ADCC活性）的效应子功能时，发现297位处天冬酰胺向甘氨酸的突变（N297G ; EU编号方案）与导致非糖基化IgGl的其它突变相比可提供极大改善的纯化效率以及生物 物理特性。在优选的实施方案中，将半胱氨酸工程改造到Fc中以允许存在二硫键，这增加 了含有非糖基化Fc分子的稳定性。非糖基化Fc的有效性超过IL-2突变蛋白Fc融合范围。 因此，本文提供了含有Fc的分子、Fc融合物和抗体，其包含N297G取代以及一个或多个额 外残基对半胱氨酸的任选取代。本专利技术的另一个方面包括糖基化肽接头。适于N-非糖基化的优选接头肽包括 GGNGT(SEQ ID N0:6)或YGNGT(SEQ ID N0:7)。附图简述图1:在短期刺激测定时，通过与IgG-Fc的C端融合的均二聚未以降低的效能并 以对CD25的高亲和力来改变IL-2突变蛋白的活性。图2A和图2B:测试具有所示突变并与Fc-异源二聚体一侧的C端融合的IL-2突 变蛋白刺激T细胞中STAT5磷酸化的能力。这些突变蛋白还包含三个对⑶25赋予高亲和 力的突变（V69A、N71R、Q74P)。将它们的活性与不具有Fc融合物的IL-2的三种形式（开 符号）比较：WT IL-2、HaWT(对CD25的高亲和力）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、 N71R、Q74P)和HaD(对CD25的高亲和力以及减小的信号传导活性）（N29S、Y31H、K35R、 T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)。显示出被门控F0XP3+CD4+和F0XP3-CD4+T细胞的磷 酸-STAT5响应。图3 :T细胞亚群响应于与Fc-异源二聚体融合的IL-2突变蛋白的滴定的增殖。将 融合蛋白的活性与不具有Fc融合物的IL-2的三种形式比较（开符号）：WT IL-2、HaWT(对 CD25的高亲和力）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)和HaD(对CD25的高 亲和力以及减小的信号传导活性）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D)图4 :NK细胞响应于与Fc-异源二聚体融合的IL-2突变蛋白的滴定的增殖。将融 合蛋白的活性与不具有Fc融合物的IL-2的三种形式比较（开符号）：WT IL-2、HaWT(对 CD25的高亲和力）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P)和HaD(对CD25的高 亲和力以及减小的信号传导活性）（N29S、Y31H、K35R、T37A、K48E、V69A、N71R、Q74P、N88D) 图5 :T细胞亚群响应于与Fc-同源二聚体N297G融合的IL-2突变蛋白的滴定的 增殖。将Fc突变蛋白的活性与WT IL-2(开环）和Fc.WT (闭环）比较。赋予对CD25高亲 和力的突变（HaMutl)为V69A和Q74P。 图6 :NK细胞响应于与Fc-同源二聚体N297G融合的IL-2突变蛋白的滴定的增 殖。将Fc突变蛋白的活性与WT IL-2 (开环）和Fc. WT (闭环）比较。 图7A和图7B :不具有赋予对CD25的高亲和力的突变的Fc. IL-2突变蛋白促进人 源化小鼠中Treg扩增和F0XP3上调。图8 :Fc. IL-2突变蛋白的低周剂量（每只动物0. 5 μg)促进人源化小鼠中Treg 扩增和F0XP3上调，相对于Fc. N88D和Fc. WT，观察到Fc. V91K具有更好的活性。图9 :Fc. V91K和Fc. N88D通过与CD25缔合而存留于活化的T细胞的表面上。优选实施方案详述本文中所用的章节标题仅用于组织目的且不应理解为对所述主题进行限制。本说 明书主体内所引用的所有参考文献全文以引用方式明确并入。来对于重组DNA、寡核苷酸合成、组织培养和转化、蛋白质纯化等可使用标准技术。 可实施根据生产厂家的说明书或者本领域通常使用的或者本专利技术所述的酶反应和纯化技 术。酶促反应及纯化技术可根据制造商说明书来实施，或以本领域内常用方法来实施，或如 本文所述来实施。参见，例如Sambrook等，2001，MolecularCloning:A Labor本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种多肽，其包含人IgG1抗体的Fc区，其中所述Fc区包含N297G突变并且所述人IgG1的Fc区包含与SEQ ID NO:3中所示氨基酸序列至少90%的同一性。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：G肯南，
申请(专利权)人：美国安进公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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