用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物技术

本文中提供了用于使已在限定条件下扩增和/或维持的诱导多潜能干细胞体外分化成能够产生单激素β细胞的内胚层前体细胞(EPC)的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于悬浮培养内胚层祖细胞的方法和组合物本申请要求于2013年4月3日提交的美国临时申请号61/808,003的优先权权益，其全部内容通过引用并入本文。
技术介绍
1.
本专利技术一般性地涉及内分泌学、干细胞和分化细胞领域。更具体地，本专利技术涉及由未分化细胞在悬浮培养物中产生自我更新的内胚层祖细胞。2.相关技术说明内胚层衍生组织(包括胰腺)潜在地可用于细胞替代治疗。可能的是，由多潜能干细胞(pluripotentstemcell，PSC)通过顺序暴露于模拟胚胎形态发生的细胞因子来体外产生在发育期间形成原肠管的定形内胚层(definitiveendoderm)及其衍生谱系。以此方式，可由胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)和诱导多潜能干细胞(inducedpluripotentstemcell，iPSC)产生胰腺细胞(D’Amour等，2006；Gouon-Evans等，2006)。尽管这些研究强调了PSC衍生的内胚层组织用于移植治疗的前景，但是仍存在若干障碍。由PSC产生的内胚层细胞易于表现出未成熟表型，并且在很多情况下，不是全功能的。例如，目前由人ESC体外产生的大部分胰腺β细胞是多激素(poly-hormonal)的并且不是葡萄糖响应性的(D’Amour等，2006；Nostro等，2011)。产生用于移植之内胚层细胞的另一个障碍是扩大生产规模以产生所需数目细胞的能力，对于胰腺细胞而言，这目前受限于在固体表面上产生的必要性。本专利技术的一个目的是提供避免了这些限制的培养方法和分离方法。
技术实现思路
本专利技术通过提供用于产生自我更新的内胚层祖细胞(下文中为“EPC”、“EP”或“EP细胞”)的有效方法克服了本领域中的一大缺陷。在第一实施方案中，提供了这样的用于产生自我更新的内胚层祖细胞的方法，其包括a)在包含激活蛋白A(ActivinA)或Nodal的无血清培养基中培养多潜能干细胞以实现内胚层细胞的诱导；以及b)在无血清培养基中之含有BMP4、VEGF、FGF2和EGF或其同源物的悬浮培养物中培养所述内胚层细胞以选择性地促进自我更新的内胚层祖细胞的生长。在一个实施方案中，提供了这样的用于产生自我更新的内胚层祖细胞的方法，其包括a)在包含激活蛋白A的无血清培养基中培养多潜能干细胞以实现内胚层细胞的诱导；以及b)在无血清培养基中之含有激活蛋白A、BMP4、VEGF、FGF2和EGF或其同源物的悬浮培养物中培养所述内胚层细胞以选择性地促进自我更新的内胚层祖细胞的生长。在一些方面，步骤b)中的悬浮培养物还可包含TGFβ。在某些方面，内胚层细胞包括定形内胚层细胞和内胚层祖细胞的群。在一些方面，将步骤b)中的内胚层细胞以约104细胞/ml、105细胞/ml、106细胞/ml、107细胞/ml、108细胞/ml或可来源于其中的任意范围的初浓度悬浮培养。优选地，将内胚层细胞以约250,000细胞/ml至2,000,000细胞/ml，更优选250,000细胞/ml至500,000细胞/ml的初浓度悬浮培养。在一些方面，步骤a)中的无血清培养基还可包含Wnt3A或GSK3抑制剂。在另一些方面，步骤a)中的无血清培养基可不包含Wnt3A或GSK3抑制剂。GSK3抑制剂的一个优选实例是CHIR99021。在一些方面，步骤a)中的培养可进行至少或约1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20天，或可来源于其中的任意范围。优选地，所述培养进行约4天至12天，更优选约5天至8天。在一些方面，步骤a)中的培养可以以贴壁培养进行。在一些方面，步骤b)中使用的内胚层祖细胞促生长因子还可包括TGF-β、潜在TGF-β结合蛋白(latentTGF-βbindingprotein)、Nodal、GSK3抑制剂、促滤泡素抑制素相关蛋白(Follistatin-relatedprotein，FSRP)、Dickkopf相关蛋白1(Dickkopf-relatedprotein1)、IndolactamV和/或胰岛素样生长因子。GSK3抑制剂的一个优选实例是CHIR99021。在一些方面，步骤b)中的培养可进行至少或约1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25天，或可来源于其中的任意范围。在一些方面，步骤b)中的所述培养可进行至少1、2、3、4、5、6个月，或可来源于其中的任意范围。优选地，所述培养进行至少约5天至约40天，更优选约10天至约15天。在一些方面，在ROCK抑制剂存在下可发生步骤b)中的培养。ROCK抑制剂可以是Y-27632、H1152或HA-100。在一些方面，可在进行最初的约12小时培养之后除去ROCK抑制剂。在一些方面，步骤b)中的悬浮培养物还可包含基质组分(例如基膜制备物(basementmembranepreparation))以支持细胞群的培养。基质组分的非限制性实例包括胶原蛋白、明胶、聚-L-赖氨酸、聚-D-赖氨酸、玻连蛋白、层粘连蛋白、PLO层粘连蛋白、纤维蛋白凝块(fibrinclot)、纤连蛋白及其混合物，例如MatrigelTM和经裂解的细胞膜制备物。基膜制备物可以以约0.06mg/ml至0.6mg/ml，优选约0.3mg/ml至0.6mg/ml的终浓度存在。在一些方面，可大约每1、2、3、4、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15(或可来源于其中的任意范围)天使步骤b)中的悬浮培养物解离并重新聚集。优选地，可大约每4天至5天使悬浮培养物解离并重新聚集。在一些方面，可将步骤b)中的悬浮培养物维持在转瓶中。可以以约40rpm至70rpm运行转瓶。在一些方面，可将步骤b)中的悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。在一些方面，内胚层祖细胞可表达CXCR4、CD117(c-KIT)和CD34。在一些方面，内胚层祖细胞还可表达Sox17、FOXA1、FOXA2和CD31。所述表达可通过蛋白质表达分析(例如ELISA或FACS分析)或者RNA表达分析(例如qRT-PCR)来检测。在一些方面，自我更新的内胚层祖细胞的形成不需要MEF饲养层或MEF条件化(MEF-conditioned)培养基的存在。在一些方面，培养发生在常氧条件下。在一些方面，培养发生在低氧条件下。在一些方面，在步骤a)之前，可将多潜能干细胞维持在低氧条件下。在一些方面，多潜能干细胞可以是胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。干细胞还可包括多能干细胞(multipotentstemcell)、寡能干细胞或单能干细胞。干细胞还可包括胎儿干细胞或成体干细胞，例如造血干细胞、间充质干细胞、神经干细胞、上皮干细胞和皮肤干细胞。在某些方面，干细胞可分离自脐带、胎盘、羊水、绒毛膜绒毛、胚泡、骨髓、脂肪组织、脑、外周血、脐带血、月经血、血管、骨骼肌、皮肤和肝。在某些方面，所述方法还包括将内胚层祖细胞与胰岛β细胞促生长因子一起培养以实现单激素胰岛β细胞(mono-hormonalpancreaticisletbetacell)的形成。在一些方面，可在培养之前对内胚层祖细胞进行纯化。所述纯化可基于标志物(例如CD34、CD本文档来自技高网...

【技术保护点】
产生自我更新的内胚层祖细胞的方法，其包括：a)在包含激活蛋白A或Nodal的无血清培养基中培养多潜能干细胞；以及b)在无血清培养基中之含有BMP4、VEGF、FGF2和EGF的悬浮培养物中培养从步骤a)得到的细胞以选择性地促进自我更新的内胚层祖细胞的生长。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.04.03 US 61/808,0031.产生自我更新的内胚层祖细胞的方法，其包括：a)在包含激活蛋白A或Nodal的无血清培养基中培养多潜能干细胞；以及b)在无血清培养基中之含有BMP4、VEGF、FGF2和EGF的悬浮培养物中培养从步骤a)得到的细胞以选择性地促进自我更新的内胚层祖细胞的生长，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含基膜制备物。2.实现单激素胰岛β细胞的形成的方法，其包括在权利要求1所述的方法的步骤b)后，进一步进行以下步骤：将根据权利要求1所述的方法产生的内胚层祖细胞与胰岛β细胞促生长因子一起培养。3.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述无血清培养基包含激活蛋白A。4.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养基还包含Wnt3A或GSK3抑制剂。5.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养基不包含Wnt3A或GSK3抑制剂。6.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养进行4天至12天。7.权利要求6所述的方法，其中步骤a)中的所述培养进行4天至8天。8.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中的所述培养以贴壁培养进行。9.权利要求1所述的方法，其中来自步骤a)的细胞包括定形内胚层细胞和内胚层祖细胞的群。10.权利要求1所述的方法，其中步骤a)中使用的所述无血清培养基还包含TGF-β、潜在TGF-β结合蛋白、Nodal、GSK3抑制剂、促滤泡素抑制素相关蛋白(FSRP)、Dickkopf相关蛋白1、IndolactamV和胰岛素样生长因子。11.权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含激活蛋白A。12.权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的所述悬浮培养物还包含TGFβ。13.权利要求1所述的方法，其中步骤b)中的所述培养进行至少7天至40天。14.权利要求13所述的方法，其中步骤b)中的所述培养进行至少7天至25天。15.权利要求1所述的方法，其中在ROCK抑制剂存在下发生步骤b)中的所述培养。16.权利要求15所述的方法，其中所述ROCK抑制剂是Y-27632或H1152。17.权利要求15所述的方法，其中在12小时后除去所述ROCK抑制剂。18.权利要求16所述的方法，其中所述基膜制备物以0.06mg/mL至0.6mg/mL的终浓度存在。19.权利要求18所述的方法，其中所述基膜制备物以0.3mg/mL至0.6mg/mL的终浓度存在。20.权利要求1所述的方法，其还包括大每5天使步骤b)中的所述悬浮培养物解离并重新聚集。21.权利要求1所述的方法，其中将步骤b)中的所述悬浮培养物维持在转瓶中。22.权利要求21所述的方法，其中以40rpm至70rpm运行所述转瓶。23.权利要求1所述的方法，其中将步骤b)中的所述悬浮培养物作为静态悬浮培养物维持。24.权利要求1所述的方法，其中将步骤b)中的所述内胚层细胞以250,000细胞/mL至2,000,000细胞/mL的初浓度悬浮培养。25.权利要求24所述的方法，其中将步骤b)中的所述内胚层细胞以250,000细胞/mL至500,000细胞/mL的初浓度悬浮培养。26.权利要求1所述的方法，其中所述内胚层祖细胞表达CXCR4、CD34和CD117(c-KIT)。27.权利要求26所述的方法，其中所述内胚层祖细胞还表达Sox17、FoxA1、FoxA2和CD31中的至少一种。28.权利要求1所述的方法，其中所述自我更新的内胚层祖细胞的形成不需要MEF饲养层或MEF条件化培养基的存在。29.权利要求1所述的方法，其中所述多潜能干细胞是胚胎干细胞或诱导多潜能干细胞。30.权利要求1所述的方法，其中所述培养发生在20％氧下。31.权利要求1所述的方法，其中所述培养发生在低氧条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：迪皮卡·拉杰什，萨拉·爱丽丝·伯顿，
申请(专利权)人：细胞动力学国际有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US