本发明专利技术公开了一种恒温扩增核酸的方法及应用，所述方法对传统LAMP扩增原理进行改进，包括六条核心引物，四条为内引物，命名为FIP1，FIP2，BIP1和BIP2；两条为外引物，命名为F3和B3，另外的四条环引物加入到反应体系中以加速扩增反应。本方法的扩增结果可以进行可视化检测，电泳检测或实时浊度检测。本发明专利技术提供的方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于各种核苷酸片段检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种新的恒温扩增技术及在细菌检测中的应用，特别是在单增李斯特 菌鉴定中的应用，属于分子生物学和微生物学领域。
技术介绍
环介导恒温扩增技术（Loop-MediatedIsothermalAmplification,LAMP)是由 Notomi等建立的一种体外核酸特异性扩增技术，具有特异性强、灵敏度高、操作简单、产物 易检测等优点。该技术已被广泛用于分子鉴定领域。LAMP针对靶序列的6个特异部位设 计4条核心引物，利用具有链置换活性的BstDNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从 而使革巴序列高效扩增。4条核心引物之中2条为内引物，即FIP(ForwardInnerPrimer， FIP)和BIP(BackwardInnerPrimer，BIP)。FIP包含Flc和F2(F2c区域的互补序列），即 5' -Flc-F2;BIP包含Blc(Bl区域的互补序列）和B2,即Y-Blc-B2。其余两条核心引 物为外引物F3和B3。另外的两条环引物（LoopPrimes,LF和LB)被增加到反应体系中加 速LAMP反应。LAMP反应包括两个过程，即哑铃状模板合成阶段和循环扩增阶段。LAMP反应的温 度为60~65°C，该温度是双链DNA复性及延伸的中间温度，双链DNA在该温度范围内处于 半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延 伸时，另一条链就会解离，变成单链。在链置换BstDNA聚合酶的作用下，以FIP引物F2区 段的:V末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F3引物与F2c前 端F3c序列互补，以3'末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出FIP引 物合成的DNA链，同时合成自身DNA，最终F3引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。 然后由FIP引物先合成的DNA链被F3引物进行链置换产生一单链，该单链通过Y末端的 Flc区段和F1区段互补，发生自我碱基配对，形成茎环状结构。同时，BIP引物同该单链杂交 结合，以BIP引物的3'端为起点，合成互补链，在此过程中茎环结构被打开。接着，B3引物 与BIP引物外侧的互补区域B3c配对结合，以3'端为起点，在聚合酶的作用下，合成新的互 补链。通过上述2个过程，形成双链DNA。被置换的单链DNA依据两端存在的互补区域，发 生自我碱基配对，形成环状结构，于是整条被置换出来的DNA在两端呈现哑铃状结构，该结 构作为LAMP反应扩增循环的起始结构。LAMP反应扩增循环阶段：首先在哑铃状结构中，以 3'末端的F1区段为起点，以自身为模板，进行DNA合成延伸。与此同时，FIP引物F2与环 上单链F2c杂交，启动新一轮链置换反应，解离由F1区段合成的双链核酸。同样，在解离出 的单链核酸上也会形成茎环结构。在茎环结构上存在单链形式B2c，BIP引物上的B2与其 杂交，启动新一轮扩增，经过相同的过程，又形成茎环结构。通过此过程，结果在同一条链上 互补序列周而复始形成大小不一的结构。LAMP反应可以特异、高效、快速的扩增目的DNA， 在1小时之内使产物的量达到1〇9个拷贝。LAMP扩增之后，其产物的检测可以通过琼脂糖电泳后染色观察。较为简便的方法 是直接在产物中加入SYBRGreenI染色，呈现绿色为阳性反应，橙红色为阴性反应。也可 以通过扩增副产物焦磷酸镁沉淀的浊度进行判断，液体浑浊，离心或有白色沉淀的为阳性 反应，无此现象的则为阴性反应。现在更为简单的方法是在反应混合物中加入可视染料，阳 性反应管的颜色从浅灰色变为绿色，阴性反应管则保持原来的浅灰色。 虽然环介导恒温技术已经被广泛的运用于分子鉴定领域，但是对于一些特殊标本 (脑脊液、腹腔积液、以及某些食品样本），其标本中不含活体微生物，无法进行分离培养。 此外这些样本的目标序列含量极低，无法运用传统的环介导恒温扩增技术进行检测和鉴 定。因此，对传统环介导恒温技术进行改进，提高环介导恒温扩增方法的敏感性，对于特殊 标本的鉴定具有重要意义。 另一方面，单增李斯特菌是广泛存在于环境中的革兰氏阳性、有运动能力、兼性胞 内寄生短杆菌，是重要的食源性人兽共患病原菌，能够引起人类严重感染。李斯特菌病的易 感人群主要为免疫力低下人群和免疫缺陷人群，前者包括老年人、新生儿和孕妇；后者为肿 瘤患者、艾滋病患者和器官移植受体等。人类李斯特菌病主要临床症状为败血症、脑膜炎、 孕妇流产、死产以及发热性胃肠炎等，该菌可穿越肠道屏障、血脑屏障和胎盘屏障。单增李 斯特菌病在人类的感染率不高，但该病的死亡率极高而受到广泛的关注，一度成为欧美国 家重大公共卫生问题。国内尚无由单增李斯特菌引起食物中毒暴发的报道，实际存在与否 不明，散发病例在多个省市都有报道。因此，为了给予临床病人准确快速的治疗和单增李斯 特菌的流行病学调查，研发一个省时、省力和特异性较高的单增李斯特菌检测方法成为必 要。目前对于单增李斯特菌分离鉴定主要依赖于传统的增菌培养和生化鉴定，该方法 耗时大约5到7天，包括二次增菌，选择培养及后续的生化鉴定，其劣势是耗时耗力，生化结 果的判读依赖于人的主观判断，导致结果重复性差，易错判。随着核酸鉴定技术的快速发 展，一些以PCR为基础的鉴定技术（如普通PCR技术，荧光PCR技术）被用于单增李斯特 菌的快速鉴定，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备，需要后续的电泳操作，昂贵的探针合 成，以及熟练的操作人员。对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。因而， 急需发展一种简单，快速，灵敏和特异的鉴定技术用于单增李斯特菌检测。
技术实现思路
基于现有技术存在的上述问题，本专利技术的目的是改进LAMP反应的原理，以LAMP反 应为基础，设计多条内引物和环引物，建立一种操作简便、特异性强、灵敏度高、检测速度快 的多重内引物LAMP检测技术，命名为MIP-LAMP(MultipleInnerPrimers-Loop-Mediated IsothermalAmplification)，以便实现LAMP技术更为广泛的应用，尤其在单增李斯特菌非 诊断目的鉴定中的应用。 基于上述目的，本专利技术首先提供了一种扩增目的基因片段并对扩增结果进行检测 的方法，即，MIP-LAMP，所述方法包括以下步骤：⑴自所述目的基因片段的3'端起，设定第一任意序列F3c，第二任意序列F2c-1， 第三任意序列Flc-Ι，第四任意序列F2c-2,第五任意序列Flc-2,自所述目的基因片段的5' 端起，设定第六任意序列B3,第七任意序列B2-1，第八任意序列B1-1，第九任意序列B2-2， 第十任意序列B1-2 ; (2)提供引物FIP1，所述引物FIP1含有与序列F2C-1互补的序列F2-1，在所述序 列F2-1的5'端连接有序列Flc-1，提供引物FIP2,所述引物FIP2含有与序列F2c-2互补 的序列F2-2,在所述序列F2-2的5'端连接有序列Flc-2,提供引物BIP1，所述引物BIP1 含有序列B2-1，在所述序列B2-1的5'端连接有与序列B1-1互补的序列Blc-Ι，提供引物 BIP2,所述引物BIP2含有序列B2-2,在所述序列B2-2的5'端连接有与序列B1-2互补本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种恒温扩增核酸的方法，所述方法包括以下步骤：(1)自所述目的基因片段的3’端起，设定第一任意序列F3c，第二任意序列F2c‑1，第三任意序列F1c‑1，第四任意序列F2c‑2，第五任意序列F1c‑2，自所述目的基因片段的5’端起，设定第六任意序列B3，第七任意序列B2‑1，第八任意序列B1‑1，第九任意序列B2‑2，第十任意序列B1‑2；(2)提供引物FIP1，所述引物FIP1含有与序列F2c‑1互补的序列F2‑1，在所述序列F2‑1的5’端连接有序列F1c‑1，提供引物FIP2，所述引物FIP2含有与序列F2c‑2互补的序列F2‑2，在所述序列F2‑2的5’端连接有序列F1c‑2，提供引物BIP1,所述引物BIP1含有序列B2‑1，在所述序列B2‑1的5’端连接有与序列B1‑1互补的序列B1c‑1，提供引物BIP2,所述引物BIP2含有序列B2‑2，在所述序列B2‑2的5’端连接有与序列B1‑2互补的序列B1c‑2，提供引物F3，所述引物F3含有与序列F3c互补的序列F3，提供引物B3，所述引物B3含有序列B3；(3)在链移位型聚合酶、解链温度调节剂、引物、所述限制性内切酶和缓冲液存在下，使用目的基因片段模板作为模板扩增DNA；(4)检测步骤(3)的扩增结果。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：叶长芸，王毅，王艳，
申请(专利权)人：中国疾病预防控制中心传染病预防控制所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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