本发明专利技术为一种细胞膜电流抑制剂在抑制Kir2.1外向电流方面的应用，该抑制剂的组成包括氢化肉桂酸和细胞浴液，其中，抑制剂中氢化肉桂酸的浓度为1～20mM；所述的细胞浴液的pH值为7.2～7.4，使用蔗糖调节其渗透压为290～310mOsm/L；利用该混合物孵育表达有Kir2.1的突变体D172N和E299V通道蛋白的细胞，消除或有效抑制其外向电流。本发明专利技术通过研究得到的细胞膜电流抑制剂对Kir2.1单点突变体D172N和E299V的外向电流抑制率接近100%，半数有效抑制浓度分别为3.67mM和2.56mM。这为研制短QT3综合症靶向治疗药物打下很好的基础。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于内向整流钟离子通道Kir2.1调节剂的筛选，具体设及氨化肉桂酸与 肥K293T细胞浴液混合物对Kir2. 1单点突变体D172N和E299V通道外向电流的抑制。
技术介绍
细胞膜上的离子通道蛋白具有通透某一种或者某几种离子的功能，其种类繁多。 内向整流钟离子通道Kir2.1是一种只能通透钟离子的孔道性蛋白。它只允许钟离子内 流而不允许钟离子外流，因此其电流表现为内向整流特性。已经发现Kir2.1单点突变体 D172N或者E299V改变了Kir2. 1通道的内向整流特性，它们引起了很强的外向电流。研究 发现正是运一很强的外向电流引起了短QT3综合征。运种屯、脏疾病是一种家族病，会引起 严重的屯、脏性巧死，从婴儿至毫晝老人均有发病表现。短QT综合症患者的屯、电图中表现为 QT间期小于360ms，小于正常值360~440ms。运是因为D172N和E299V引起的外向电流会 加速屯、肌细胞复极化时间，进而缩短QT间期，引起短QT3综合症。 迄今为止，治疗短QT3综合症的主要方法是在人体内植入除颤器。但是除颤器会 引起非常严重的神经性损伤，对儿童及幼儿，根本无法利用除颤器进行治疗短QT3综合征。 婴幼儿患上了运种疾病只有面临死亡。但是药物治疗是解决运一问题的很好途径，可W通 过药物来抑制D172N和E299V通道的外向电流来进行治疗运种疾病。迄今为止，Kir2. 1外 向电流的抑制剂极度缺乏，所W寻找Kir2.1外向电流的抑制剂，就变得相当迫切。 氨化肉桂酸是一种化合物单体，其常用于饼干、冰激凌和糖果等的增香剂。此外， 氨化肉桂酸作为中间体还常用于医学领域，可见其对人体副作用很小。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是针对当前Kir2. 1内向整流钟离子通道电流抑制试 剂缺乏的情况下，提供一种细胞膜电流抑制剂，其组成包括氨化肉桂酸与细胞浴液。该抑制 剂能够对表达于肥K293T细胞的Kir2. 1通道的突变体D172N或E299V的外向电流起到很 强的抑制作用。利用含有20mM氨化肉桂酸的细胞浴液混合物解育转染D172N或E299V的 肥K293T细胞，则膜片错记录到的Kir2. 1的突变体D172N或E299V的外向电流消失。当再 灌流无氨化肉桂酸的细胞浴液，则D172N或E299V通道电流得到恢复，运说明氨化肉桂酸与 细胞浴液混合物未破坏Kir2.1通道蛋白的结构。运些实验结果证明了氨化肉桂酸与细胞 浴液的混合液对Kir2. 1通道外向电流起到抑制作用，为Kir2. 1突变体D172N和E299V外 向电流的抑制剂。 本专利技术的技术方案为： 阳007] -种细胞膜电流抑制剂，该抑制剂的组成包括氨化肉桂酸和细胞浴液，其中，抑制 剂中氨化肉桂酸的浓度为1~20mM;所述的细胞浴液的抑值为7. 2~7. 4,使用薦糖调节 其渗透压为290~310m0sm/L。 阳OO引所述的细胞电流抑制剂在抑制Kir2.1外向电流方面的应用，利用该抑制剂解育 表达有Kir2. 1的突变体D172N和E299V通道蛋白的细胞，消除或有效抑制其外向电流。 具体包括W下步骤： (1)配制细胞浴液； (2)将氨化肉桂酸加入到含有细胞浴液的离屯、管中，20~40摄氏度下超声波振荡 至固体全部溶解，得到氨化肉桂酸浓度为1~20mM的细胞浴液； (3)利用上面得到的细胞膜电流抑制剂解育表达有Kir2. 1单点突变体D172N或 E299V蛋白的肥K293T细胞，最终得到Kir2. 1单点突变体D172N或E299V外向电流被抑制 或消除的肥K293T细胞。 所述的细胞浴液优选为细胞浴液a、细胞浴液b、细胞浴液C、细胞浴液d或者细胞 浴液e;其中， 所述的细胞浴液a的组成包括：116.88mM的KCl，5mM的MgClzJmM的邸TA, 2. 83mM 的皿2?〇4,7. 17mM的K2HPO4,溶剂为超纯水，KOH调节溶液抑为7. 3,薦糖调节渗透压为 290 ~310m0sm/L; 阳01引所述的细胞浴液b的组成或者包括：浓度分别为HOmM的KC1，IOmM的K-肥阳S，ImM的K-EGTA，溶剂为超纯水，KOH调节溶液抑为7. 3,薦糖调节渗透压为290~SlOmOsm/ L；所述的细胞浴液C的组成包括：浓度分别为1IOmM的KCl，IOmM的KH2PO4, 2mM的 邸TA, 5mM的肥阳S，1. 9mM的KzATP,溶剂为超纯水，KOH调节溶液抑为7. 3,薦糖调节渗透 压为 290 ~310m0sm/L; 所述的细胞浴液d的组成或者包括：浓度分别为123mM的KC1，5mM的 Kz邸TA, 7. 2mM的K2HPO4,SmM的KH2PO4,溶剂为超纯水，KOH调节溶液抑为7. 3,薦糖调节渗 透压为 290 ~310m0sm/L; 所述的细胞浴液e的组成包括：浓度分别为120mM的KC1，4mM的K2邸TA, 7. 2mM的 馬册〇4,2.SmM的皿2?〇4,溶剂为超纯水，KOH调节溶液抑为7. 3,薦糖调节渗透压为290~ 310m0sm/L〇 本专利技术的有益效果是： 近十年，Kir2. 1通道内向电流的抑制剂相继被发现，比如ML133、他莫西芬、氯乙 基可乐定。但Kir2. 1突变体D172N和E299V产生外向电流的抑制剂还未见描述。而运些 外向电流恰恰是短QT3综合征发病的主要原因所在。所W寻找D172N和E299V外向电流的 抑制剂对已研究开发短QT3综合征祀向治疗药物起着非常关键的作用。 本专利技术通过研究得到的细胞膜电流抑制剂对Kir2. 1单点突变体D172N和E299V 的外向电流抑制率接近100 %，半数有效抑制浓度分别为3. 67mM和2. 56mM。运为研制短 QT3综合症的有效治疗药物打开了 一扇大n。而且氨化肉桂酸作为一种化合物单体，相对于 采用混合物与细胞浴液组成的抑制剂，其对人体副作用小，更加有利于祀向药物进一步的 研制。【附图说明】 图1为实施例1中，通过膜片错内向外模式记录到的转染Kir2. 1突变体Dl72N的 肥K293T细胞上的电流随膜电位的变化，横坐标为电压，纵坐标为电流。其中： 图1A，未灌流氨化肉桂酸的Kir2. 1突变体D172N电流特征曲线； 图1B，20mM氨化肉桂酸和细胞浴液混合液灌流后的Kir2. 1突变体D172N的电流 变化曲线； 阳0巧]图1C，利用细胞浴液冲掉含20mM氨化肉桂酸的细胞浴液后的Kir2. 1突变体D172N的电流变化。 阳0%] 图2为实施例1中，含有20mM氨化肉桂酸的细胞浴液对D172N在+30mV时外向电 流的影响，其中HA表示氨化肉桂酸；图3为实施例2中，含有不同摩尔浓度氨化肉桂酸的细胞浴液混合液对Kir2. 1 突变体D172N外向电流抑制百分比与混合物中氨化肉桂酸浓度的变化关系，也就是量效曲 线。横坐标为细胞浴液中含有氨化肉桂酸的摩尔浓度，纵坐标为抑制Kir2. 1突变体D172N 外向电流的百分比。ICsc= 3. 67mM。 阳02引图4为实施例3中，通过膜片错内向外模式记录到的转染Kir2. 1突变体E299V的 肥K293T细胞上的电流随膜电位的变化，横坐标为细胞膜电压，纵坐标为通道电流。其中： 图本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种细胞膜电流抑制剂在抑制Kir2.1外向电流方面的应用，其特征为该抑制剂的组成包括氢化肉桂酸和细胞浴液，其中，抑制剂中氢化肉桂酸的浓度为1～20mM；所述的细胞浴液的pH值为7.2～7.4，使用蔗糖调节其渗透压为290～310mOsm/L；应用该抑制剂孵育表达有Kir2.1的突变体D172N和E299V通道蛋白的细胞，消除或有效抑制其外向电流。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：安海龙，任树喜，展永，李军委，柳辉，
申请(专利权)人：河北工业大学，
类型：发明
国别省市：天津;12
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