一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及应用技术

本发明专利技术公开了一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及应用，取2mL 100g/L活化土样加入到48mL 25mg/L芘溶液中，28℃振荡培养5d；取2mL富集液加入到48mL 50mg/L芘溶液，28℃振荡培养5d；循环往复，直到芘浓度为0.2g/L。经筛选驯化得到三株能高效降解多环芳烃的真菌：踝节菌，残孔菌和尖孢镰刀菌。在优化条件下，踝节菌对多种多环芳烃均能高效降解，尤其对芘的降解效果优于其它菌株。利用HPLC和质谱证实了踝节菌对多种多环芳烃的降解。从踝节菌和残孔菌提取的生物絮凝剂亦能降解芘，菲，萘，苊等多环芳烃。筛选得到的踝节菌属对高岭土的絮凝率达到90％。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于微生物
，涉及一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法及 应用。
技术介绍
多环芳烃（PAHs)是一类分子中含有两个以上苯环的有机化合物。这类物质化学 性质稳定，毒副作用大，易对人类造成致畸性、致癌性和致突变性等危害。环境中多环芳烃 的沉积主要来源于煤和石油的燃烧，工业生产、垃圾焚烧、汽车尾气排放等也会造成PAHs 的大量增加。环境中PAHs数量多分布广，难以集中治理，用物理和化学修复方法难以将它 们完全消除，还会对环境造成二次污染，生物修复技术能很好的解决上述问题。 我国有多种红豆杉属植物，其次生代谢产物紫杉醇具有抗癌功效。对红豆杉的药 用价值研究很多。目前，红豆杉属植物内生菌种类及其次生代谢产物已成为研究热点。南 方红豆杉是我国特有物种，其内生真菌种类丰富多样，李冬利等从南方红豆杉的叶、枝条、 树皮及果实中共分离到内生真菌55株，通过形态学和分子生物学鉴定，发现其中4株菌可 能为新种。宋培勇等从南方红豆杉的茎、皮和叶分离出52株细菌，用分子生物学方法确定 其种属。郝大程等用克隆测序方法首次揭示南方红豆杉根际微生物多样性，但至今对其功 能潜力所知甚少，从中分离出能降解多种PAHs的微生物具有重要的理论价值和工程实践 意义，并有利于红豆杉资源的可持续综合利用。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术中存在的缺陷，提供一种红豆杉根际多环芳烃降 解菌的筛选方法。该方法对红豆杉根际真菌进行驯化，筛选出以芘为唯一碳源的三个菌株， 解决环境中多环芳烃的污染问题。操作简便易行，可直接应用于生产实践。 其具体技术方案为： 一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法，包括以下步骤： 取2ml100g/L活化根际土样加入到48ml25mg/L芘溶液中，28°C振荡培养5d;取 2ml富集液加入到48ml50mg/L芘溶液，28°C振荡培养5d;循环往复，直到芘浓度为0. 2g/ L;经过形态观察及rDNA-ITS序列分析鉴定出踝节菌属（Talaromycesverruculosus，T)， 残孔菌属（Abortiporusbiennis，R)和尖抱镜刀菌（Fusariumoxysporum，F)，踝节菌属和 残孔菌属是用浓度为0. 2g/L芘驯化筛选出的优势菌，尖孢镰刀菌不能耐受高浓度芘，只能 在含50mg/L芘的平板上生长。将纯化的踝节菌属接入装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶 中，在30°C、150r/min的摇床中培养2d;取发酵液测絮凝率，经多次连续传代，踝节菌属的 絮凝率均达到90%。 进一步，所述踝节菌属（简称T)于2014年11月2日保藏于中国典型培养物保藏 中心，菌种保藏号为CCTCCNo:M2014542。 本专利技术所述踝节菌属在去除环境中PAHs污染物过程中的应用。 本专利技术的有益效果是： 本专利技术不仅修复成本低、无二次污染，还可以大面积的应用到环境治理中，是去除 环境中PAHs等污染物的重要而有效的途径。 保藏信息 踝节菌属DJTU_SJ5(TalaromycesdalianensisDJTU-SJ5)，已经保藏于中国典型培养 物保藏中心，保藏编号CCTCCN0:M2014542,保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏日期 为2014年11月2日。【附图说明】 图1为本专利技术的实验流程图； 图2为苯并芘的降解图； 图3为芘的降解图； 图4为菲的降解图； 图5为萘的降解图； 图6为苊的降解图； 图7为苯并芘的色谱图； 图8为菌株T降解苯并芘的代谢产物的LC-MS分析和推测的结构图，其中图8a产 物1的离子碎片，图8b产物2的离子碎片，图8c产物3的离子碎片； 图9为尖孢镰刀菌； 图10为踝节菌； 图11为残孔菌；图12为菌株T在优化条件下对花、菲、萘、苊的降解图； 图13为菌株R在优化条件下对花、菲、萘、苊的降解图； 图14为混合菌T+R在优化条件下对花、菲、萘、苊的降解图； 图15为pH对T和R的絮凝活性的影响； 图16为时间对T和R絮凝活性及生长的影响； 图17为发酵温度对T和R絮凝活性的影响； 图18为碳源种类对T和R絮凝活性的影响； 图19为菌株的絮凝图。从左至右：对照（未加菌），T(加踝节菌），R(加残孔菌）； 图20为絮凝剂T和R对四种PAHs的降解。【具体实施方式】 下面结合具体实施例对本专利技术的技术方案作进一步详细地说明。 实施例1产物液相实验 1. 1实验试剂 苯并芘（97% )，CAS号：50-32-8,百灵威科技有限公司；芘（97% )，CAS号： 129-00-0,阿拉丁试剂有限公司；菲（97% )，CAS号：85-01-8,阿拉丁公司；萘（95% )，CAS 号：91-20-3,上海信裕生物科技有限公司；苊（95% )，CAS号：83-32-9,上海信裕。1. 2培养基及溶液 (1)多环芳烃丙酮溶液：取0. 25g多环芳烃溶于50mL丙酮溶液中，配成5g/L储备 液备用。 (2)种子培养基：牛肉膏5g，蛋白胨10g，NaCl5g，蒸馏水1000mL。 (3)无机盐培养基：磷酸缓冲溶液 6mL、MgS04 ·Η20 (24. 5g/L) 3mL、CaCl2 (lg/L)lmL、 FeCl3 (lg/L) 2mL、ZnS04 ·H20 (lg/L) 2mL、MnS04 ·H20 (0· 5g/L)lmL，定容至 1L。 (4)磷酸缓冲溶液：K2HP04 · 3H20 26. 12g、KH2P04 ·H20 6. 8g、NH4C1 5.Og、 Na2HP04 · 12H2035. 8g，蒸馏水lOOOmL。 1.3多环芳烃降解实验 本实验通过均匀设计优化，提高菌株对高浓度底物的降解率，测定菌株T在7天内 对100mg/L花、150mg/L菲、200mg/L萘和200mg/L危的降解，同时证实菌株Τ对20mg/L苯 并芘的降解效果。 (1)菌悬液制备：挑取纯化后的菌株T放入100mL种子培养基中进行摇瓶培养， 30°C，150r/min振荡培养48h。对20mL培养液，在6000r/min离心20min，去掉上清液保留 菌体，用磷酸缓冲液清洗并离心，再用该缓冲液将清洗后的菌体配成5mL较浓的菌悬液。 (2)苯并芘降解实验：取lmLlg/L苯并芘丙酮溶液加入无机盐培养液中，使体系 体积为50mL，苯并芘浓度20mg/L。用纱布封住瓶口，35°C，150r/min振荡50min，促使培养 液中的丙酮挥发，以减少丙酮对菌体的毒副作用。加入菌悬液，30°C，150r/min振荡培养7 天，测定降解率。 (3)芘、菲、萘、苊的降解过程同上述苯并芘的降解实验。 1. 4固相萃取-液相色谱检测降解产物 具体过程：降解液6000r/min离心25min。去掉菌体收集上清液，用0. 22μπι滤 膜进行过滤处理，然后用固相萃取仪将溶液中的苯并芘洗脱出来。萃取采用C-18固相萃 取柱，二氯甲烷作洗脱溶剂，萃取过程：①活化C-18柱子：依次用10mL二氯甲烷、10mL甲 醇、10mL超纯水冲洗柱子，冲洗速度3mL/min;②过样：加入待萃取样品，洗脱速度1~2mL/ min，使待测组分保留在吸附柱上，真空抽滤lOmin;③洗脱：用10mL二氯甲烧以1~2mL/ mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种红豆杉根际多环芳烃降解菌的筛选方法，其特征在于，包括以下步骤：取2ml 100g/L活化土样加入到48ml 25mg/L芘溶液中，28℃振荡培养5d；取2ml富集液加入到48ml 50mg/L芘溶液，28℃振荡培养5d；循环往复，直到芘浓度为0.2g/L；经过形态观察及rDNA‑IT5序列分析鉴定出踝节菌属，残孔菌和尖孢镰刀菌；踝节菌属和残孔菌属是在浓度为0.2g/L芘驯化筛选出的优势菌；将纯化的踝节菌属接入装有50mL发酵培养基的250mL摇瓶中，在30℃、150r/min的摇床中培养2d；取发酵液测絮凝率，经多次连续传代，踝节菌属的絮凝率均达到90％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：郝大程，胡文丽，宋思梦，朱秀华，
申请(专利权)人：大连交通大学，
类型：发明
国别省市：辽宁;21