本发明专利技术的目的是提供一种猪伪狂犬病毒的检测方法,本发明专利技术的方法使用针对氨基酸序列为SEQ ID NO:1的gE蛋白的高特异性单克隆抗体,基于该单抗建立的阻断ELISA方法具有特异性高、灵敏度强、无假阳检测的特点,从而为PR准确诊断提供科学的依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于家畜疾病诊断
,具体涉及一种猪伪狂犬病毒检测方法。
技术介绍
猪伪狂犬病(PseudorabiesPR)是由猪伪狂犬病病毒(PseudorabiesvirusPRV) 引起的猪、牛、羊等多种家畜及野生动物的一种高度接触性、急性传染病。猪是PR主要的 天然宿主和最主要的传染源。各年龄阶段的猪只均可被感染,该病在猪群多呈暴发性流 行,给我国乃至全球的养猪业带来了巨大的经济损失。目前,主要依靠接种gE基因缺失的 Bartha-K61弱毒疫苗来预防本病。但是2011年以来我国多省份出现了新的毒力更强变异 毒株,造成了很大的经济损失,即使接种的猪只也不能幸免于难,出现了不同年龄段猪的死 亡。表明Bartha-K61弱毒疫苗已经不能提供完全的保护力。 而且,由于病毒基因组很容易发生变异,导致已有的用于检测的抗体失去效果,这 就加大了对于PRV进行正确诊断的困难,因此迫切需要建立一种特异性高的PRV进行鉴别 诊断的方法,从而为PR正确诊断提供科学的手段。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供,用本专利技术制备的针对PRV gE 蛋白的高特异性单克隆抗体,基于该单抗建立的阻断ELISA方法具有特异性高、灵敏度强、 无假阳检测的特点,从而为PR准确诊断提供科学的依据。 本专利技术首先提供一种具有新的具有良好免疫原性的gE蛋白,较以前报道的PRV的 gE蛋白,在第48位和第492~496位各有1个天冬氨酸的插入,该区域恰好处于gE蛋白抗 原表位所处的结构域中,氨基酸的插入很可能改变了已知毒株存在的抗原表位,造成其致 病性增强,其氨基酸序列为SEQ ID NO: 1 ; 编码上述gE蛋白的基因,其一种核苷酸序列为SEQ ID NO: 2; 上述的gE蛋白作为抗原用于制备抗体; 本专利技术再一个方面提供一种检测患病猪群抗体的阻断ELISA方法,包括如下的具 体步骤: 将gE蛋白抗原经过稀释液稀释,定量包被在ELISA 96孔板中,4°C过夜; 用PBST洗涤液对未结合的抗原进行清洗; 分别将阴性血清、阳性血清和待检血清加到相应的检测孔中,轻微震动,使反应板 中的液体混匀; 将微量反应板密封后置于37°C孵育; 垂直倒掉反应板中的液体,并用洗涤液进行对每个孔进行清洗; 用封闭液对反应板进行封闭,置于37°C孵育; 去除反应板中的液体,并用洗涤液进行对每个孔进行清洗; 将稀释好的酶标单抗加入到每个反应孔中,置于37°C孵育; 倒掉反应板中的液体,并用洗涤液进行对每个孔进行清洗; 添加底物,置于37 °C中反应; 加入终止液,终止反应,并于酶标仪读取450nm吸光度值,样品值/阴性值大于2 判定为阳性,小于1为阴性。 其中阴性血清的制备方法为:未经免疫小鼠血清为阴性血清; 阳性血清是gE蛋白免疫小鼠的分离血清。 所述的封闭液为:5%脱脂奶粉 洗涤液为:含0·5%。吐温-20的PBS溶液; 所使用的酶标单抗,其制备方法为: 将用于酶标的单克隆抗体进行纯化后,对单克隆抗体进行辣根过氧化物酶(HRP) 进行酶标,具体步骤如下: 称取5mg HRP溶于0· 5ml蒸馏水中; 加入0· 5ml0· 06MNaI04,4°C轻摇30min,溶液呈现黄绿色; 加入0. 5ml0. 16M乙二醇,室温下避光轻摇30min,终止氧化反应; 加入5mg抗体,装入透析袋中,置于0· 05M,pH为9. 6的碳酸盐缓冲液(CBS)中, 4°C透析过夜,期间更换至少3次CBS; 取出透析袋中的液体,加入5mg/mlNaHB40. 2ml,4°C过夜; 加入等体积饱和硫酸铵溶液沉淀结合物,4°C30min后,3000rpm离心15min,丢弃 上清; 将沉淀物溶于PBS中,装入透析袋中,并以PBS为缓冲液透析6-12h,更换3次透析 液; 最后,将获得的液体-20 °C分装保存。 终止液为:2MH2S04。制备方法是蒸馏水178. 3ml,逐滴加入浓硫酸21. 7ml。 本专利技术的通过制备具有特异性高的单克隆抗体,并建立基于该单克隆抗体检测PR 毒株的方法,从而对目前流行的PR毒株具有良好的鉴别诊断的作用。【具体实施方式】 下面结合具体实施例来进一步对本专利技术进项详细描述,本领域的普通技术人员在 本专利技术技术方案的基础上,可以选用本领域常用的方法步骤,而不仅限于本专利技术说明书实 施例的具体记载。 实施例1 :PRV主要抗原gE基因质粒的克隆、转化以及表达载体的构建 采用生物信息学方法,并结合相关的文献报道,本专利技术选取了gE基因包含主要抗 原位点膜外区域lbp~1275bp共计1275bp的基因序列进行扩增,扩增采用的模版DNA为 本实验室经过前期优选并送往菌种包藏中心编号为CGMCCNo. 10266毒株。 PCR扩增后得到1275bp的目的片段,并将其与pMD-19T载体连接,测序正确后,经 过BamHI和Xhol双酶切后,胶回收后将其连接到经过相同酶切的pGEX-6p-l表达载体上, 测序正确后命名为pGEX-gE进行菌种保存,并用于下游实验。对质粒进行测序得到目的片 段的核苷酸序列为SEQ IDN0:1,编码的氨基酸序列为SEQ IDN0:2; 对新分离的gE核苷酸序列进行比对其与以前分离的毒株的亲缘关系相对较远。 gE基因第48位和第492~496位各有1个天冬氨酸的插入。而以前分离到的毒株只个别 有一个位置插入氨基酸,绝大部分没有插入。这很可能是现有疫苗不能提供完全保护的原 因所在。 表1 :扩增中用到的引物 实施例2 :gE基因的原核蛋白表达、分析与纯化 将重组质粒pGEX-gE转化表达感受态BL21 (DE3),挑取K+LB平板上的白色单菌落, 接种于5ml含A+的LB培养液中37°C过夜培养。次日,将菌液按1 :100比例接种于含K+的 LB培养液中,37°C摇床振荡培养至0D_Ji到0. 4~0. 6时,并对表达的温度、IPTG诱导浓 度、诱导时间等条件进行摸索以确定蛋白的最优表达条件。将表达的蛋白经过SDS-PAGE表 达情况的分析,并经琼脂糖扩散实验对表达蛋白的抗原性进行分析。大量扩增目的蛋白,并 利用GST蛋白纯化试剂盒对可溶性蛋白进行纯化,并通过BCA试剂盒以及nanodrop2000 对蛋白含量进行测定。 实施例3 :单克隆抗体的制备 L动物免疫 以纯化后的原核表达重组蛋白gE为免疫原,免疫4~6周龄雌性Balb/c小鼠。共 免疫3次,每次间隔两周。一免将纯化后的重组蛋白gE蛋白与等体积的弗氏完全佐剂混合 乳化,免疫途径为皮下免疫;第二、三次免疫均将纯化gE与等体积的弗氏不完全佐剂混合 乳化,免疫途径为腹腔免疫。三次免疫剂量均为1〇〇μg/只。细胞融合前3d,对免疫效果好 的Balb/c小鼠腹腔注射100μg纯化gE蛋白(不加佐剂),进行加强免疫。 2.PRV纯化 将PRV接种Vero细胞,Μ0Ι= 1。37°C温箱孵育,48h~72h后收获细胞。 将收获的细胞反复冻融三次后,4°C4OOOrpm离心30min,继而再8OOOrpm离心 60min,弃沉淀。 将收集的上清超速离心,4°C25OOOrpm离心lh30min,弃上清。 用适量的PBS溶解沉淀,经20 %、40 %和60 %蔗糖密度梯度4°C30O本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种gE蛋白,其特征在于,所述的gE蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:1。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:李明义,孙伟,刘杉杉,刘阳,李晓林,冯晶晶,李彦凤,葛栋,李佳棋,张伦,常娓娓,
申请(专利权)人:山东信得科技股份有限公司,
类型:发明
国别省市:山东;37
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