一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其生产方法技术

本发明专利技术的目的是提供一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其生产方法，本发明专利技术用于制备猪瘟病毒基因重组腺病毒的基因片段，其氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其一种编码的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。将上述的基因片段同源重组到人5型复制缺陷型腺病毒基因组的多克隆位点制备出猪瘟病毒基因重组腺病毒。本发明专利技术的贴壁培养HEK 293细胞生产猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒的最佳工艺是：20％W-DMEM复苏HEK 293细胞，48h后，用10％W-DMEM扩传细胞，24h后按3％接毒，IFU最大，随着病毒多次复壮，1％接毒比例，感染48h收毒，能够收获到高病毒滴度的病毒。为此，将收获的病毒液进行及时冻干，建立起不同代次的冻干种毒批，为悬浮培养大量制备高水平病毒滴度提供可靠的种毒。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于病毒疫苗制备
，具体涉及一种猪瘟病毒基因重组腺病毒及其 生产方法。
技术介绍
猪痕（CSF)是由猪痕病毒（Classicalswinefevervirμs，CSFV)引起的一种 猪的高度接触性传染病，死亡率极高，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。猪瘟已被世界 动物卫生组织（0ΙΕ)列为家畜Α类传染病，我国也将其列为一类动物疫病。临床以稽留高 烧、皮肤和黏膜出现大量出血点为特征。多年的实践经验证明，疫苗接种是预防和控制动物 疫病的主要手段。20世纪60年代，我国研制出经人工诱变获得的猪瘟兔化弱毒株（又称C 株）疫苗在CSFV防控中起到了决定性作用，有效的控制了猪瘟在我国乃至世界范围内大规 模的流行。猪瘟C株弱毒疫苗是目前国内外广泛使用的疫苗，其安全性和免疫效力已被社 会认可。但其受母源抗体干扰，导致免疫失败的现象时有报道，接种此弱毒疫苗产生的抗体 无法与野毒感染产生的抗体相区分，给免疫的制订和国家猪瘟防控净化也带来了巨大的挑 战，制约着我国生猪及猪肉制品在非免疫国家和地区的贸易发展。目前广泛使用的猪瘟疫苗（猪瘟脾淋苗、猪瘟乳兔苗）都需要用活体动物生产，组 织毒生产工艺繁琐，人员工作量大，疫苗生产厂家能否严格做到使用未曾接种过兔瘟疫苗 的兔子来做疫苗，也是一个值得怀疑的问题。随着生物安全、动物福利越来越被人们重视， 国际上不再提倡用活体动物组织制备疫苗。以活病毒表达载体为基础的基因工程载体疫苗 的研制是当今病毒病防治与专利技术的热点之一。腺病毒具有应用方便、表达效率高、使用安全 及重组病毒遗传特性稳定等特点，受到了各国学者的重视，目前已应用于新型减毒活疫苗 和基因治疗的专利技术中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供，从而弥补现有 技术的不足。 本专利技术首先提供一种能用于制备猪瘟病毒基因重组腺病毒的基因片段，其氨基酸 序列为SEQIDN0:2,其一种编码的核苷酸序列为SEQIDNO: 1 ; 本专利技术还提供一种猪瘟病毒基因重组腺病毒，是将上述的基因片段同源重组到人 5型复制缺陷型腺病毒基因组的多克隆位点制备的。 本专利技术制备的猪瘟病毒基因重组腺病毒用于制备疫苗； 本专利技术另一方面提供了一种猪瘟病毒基因重组腺病毒疫苗的生产方法，具体是利 用贴壁培养HEK293细胞生产猪瘟病毒基因重组腺病毒。 上述方法的一种具体操作如下：用20%浓度的W-DMEM培养基复苏HEK293细胞， 在复苏48h后，用10%浓度的W-DMEM培养基进行HEK293细胞的扩大培养，培养24h后接 种上述的重组腺病毒，感染48h后收获到高病毒滴度的病毒，再制备成疫苗。【附图说明】 图1 :不同培养基下HEK293细胞的生长曲线图， 图2 :不同储存条件病毒滴度结果图， 图3 :不同接毒比例病毒滴度结果图； 图4 :不同收毒时间病毒滴度结果图， 图5 :细胞病变与间接免疫荧光检测图（200X);其中，A:HEK293细胞病变；B:HEK 293正常细胞；C:rAd-E0-E2感染HEK293细胞IFA检测；D:rAd-E0-E2未感染HEK293细 胞阴性对照。【具体实施方式】 申请人在猪瘟活疫苗的研究基础上，利用人5型腺病毒基因组作为骨架构建了感 染性分子克隆，在其基因组的多克隆位点区插入所筛选出CSFV的基因抗原优势区（共585 个氨基酸）。获得的重组病毒在细胞上连续传了 60代，插入的外源基因片段没有发生任何 突变或丢失，而且通过免疫荧光检测到外源基因稳定表达，提供的保护性相比于脾淋苗效 果更好，并且具有腺病毒特征性基因，能够和疫苗毒与野毒感染相区分，同时能区分CSFV 和脾淋苗（包括野毒）。用该重组病毒制备的疫苗不但可以通过抗体鉴别技术区分疫苗免 疫动物和野毒感染动物，极大地促进CSFV的净化或根除，可提高猪的存活率，增加猪的存 栏量和出栏量，对猪肉市场上相关畜产品的供应和稳定物价具有重要的意义。 本专利技术通过不同培养基培养HEK293细胞，选择最适宜HEK293细胞生长的培养 基；再用同代次不同储存条件的病毒感染HEK293细胞、同病毒不同接毒比例感染细胞、同 病毒同比例感染细胞，不同收毒时间，比较病毒滴度IFU的大小。本专利技术利用贴壁培养HEK 293细胞生产猪瘟病毒基因重组腺病毒，进行了不同培养基、病毒不同储存条件、不同接毒 比例、不同收毒时间摸索试验。 下面对本专利技术的一种猪瘟病毒基因重组腺病毒疫苗的HEK293细胞贴壁生产工艺 方法进行详细的描述。 实施例1 :猪瘟病毒E0-E2基因重组腺病毒的制备 1. 1通过对猪瘟石门系强毒（CSFV)的基因组序列进行分析，得到了具有抗原性的 核苷酸片段，并对其序列进行改造，改造后的核苷酸序列为SEQIDN0:1，编码的氨基酸序 列为SEQIDN0:2。上述片段制成的疫苗，相比于已报道的疫苗，其免疫性能更好。将改造后 的基因克隆入PET32a(+)多克隆酶切位点，转化DH5a大肠杆菌，涂氨苄抗性平板，挑取单克 隆，测序鉴定。选择测序正确的阳性菌落，挑取单克隆，测序鉴定。 1. 2将目的基因定向克隆于穿梭质粒载体pAdTrack-CMV中，采用"两步转化法"在 细菌内同源重组，构建出携带目的基因的重组腺病毒转移载体质粒pAdEasy-E02,经PacI 酶切线性化后转染人胚胎肾细胞（HEK293)，成功包装出猪瘟病毒目的基因的重组腺病毒。 1. 3将此猪瘟病毒目的基因重组腺病毒颈部肌肉注射免疫3~5周龄断奶健康仔 猪5头，取5头作为空白对照，分别于免后28日采集血清，检测猪瘟病毒抗体水平，并对10 头猪进行攻毒，攻毒前检测猪瘟抗体水平，攻毒后采用PCR检测方法检测有无猪瘟病毒残 留，以此来确定该疫苗的免疫和保护效果。经检测结果如下表1，说明该重组腺病毒疫苗免 疫效果良好。 表1猪瘟病毒目的基因重组腺病毒免疫猪28天抗体检测结果 实施例2 :不同培养基HEK293细胞贴壁培养生长工艺 2. 1HEK293细胞培养从液氮罐中取出3支同一批次HEK293冻存细胞，快速将其 放在37°C水浴中，轻轻摇晃，使之迅速融化。吸出溶有细胞的冻存液，分别加到事先装有培 养液（37°C预热，6~8mL)的离心管内，轻柔吹打混勾，1000g/min离心5min，弃上清，分别 加入 10mL含 20%血清（WeikeshengFBS、GibcoFBS、GibcoNCS)的DMEM培养基，轻柔吹 打成细胞悬液，分别于10mL培养瓶内，37°C、5% 0)2培养箱下培养。 2. 2不同培养基的摸索复苏细胞48h后换液1次，待细胞的融合度约90%时，用 PBS清洗一次，加入少许胰酶覆盖细胞面，静止消化lmin。分别加入10%(W、G、N)的培养 基，温和吹打混匀，以2. 5X105/mL密度于24孔板，每种培养基分8组，每组3孔，37°C、5 % C〇2培养箱下培养，每24h计数一次，每次计3孔，连续计数8天，将所得数据以培养时间为 横坐标，细胞数目为纵坐标绘制曲线，即可得到细胞生长曲线，观察不同血清培养基条件下 细胞生长情况及其细胞数目。 2. 3不同培养基HEK293细胞生长结果HEK293细胞的生长曲线可以看出（图1)， 同一时间细胞计数，10%W-DMHM培养条件下的细胞数目比10%N本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因，其特征在于，所述基因编码蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张小苗，张恒，范根成，孙永科，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37