用于纯化抗体的连续多步骤方法技术

本发明专利技术提供仅使用从母液制得的4种缓冲溶液的三步层析方法，用于蛋白质具体而言单克隆抗体的小规模和大规模纯化。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及使用4种缓冲溶液的三步层析方法，其用于小规模和大规模纯化蛋白 质，具体而言单克隆抗体。 专利技术背景抗体纯化可为生物生产中的最昂贵方面之一。通常使用三步、三树脂层析过程 (在每一步骤中使用特定缓冲体系）来纯化单克隆抗体（mAb)。该惯用纯化过程涵盖捕获 步骤，随后进行离子交换步骤，且以精制步骤（polishingst印）结束，且通常耗费3至5个 工作日（包含储存和开放阶段（openphase))。在这些惯用过程中，这三个步骤在不同单元 操作组成的序列（sequence)中实施，其不能以连续模式操作，这是由于需要在每一步骤之 间调节pH、摩尔浓度和蛋白质浓度。这一惯用纯化过程示于图5中。因此，惯用纯化过程 通常需要多种不同缓冲液以及位于每一不连续步骤之间的多种储存单元。这些惯用纯化过 程因此易于产生污染、技术故障和人为错误。另外，因在用于浓缩洗脱物、调节pH和电导率 及在下一步骤前储存洗脱物的每一步骤间需要打断，且因步骤不能在完成先前步骤之前开 始，因此这些惯用纯化过程特别的长且昂贵，如在图7中可见。 随着逐渐增加的细胞培养物滴度和更大的细胞培养体积被用于生产，下游处理被 视为工业瓶颈。其与单克隆抗体生产尤其相关，其中焦点已从批料体积转移，且转向下游处 理能力。另外，早期临床前及临床阶段研究需要较大量可更快速产生的抗体。因此，在工业 中需要可以连续模式实施的过程/方法/工艺用于抗体纯化，且用于缩短获得批料所耗费 的时间，减小污染、技术故障及人为错误的风险并减小工艺规模放大的需求。 专利技术简述 专利技术人发现了一种用于纯化抗体的新方法，所述方法包含呈连续模式的有限数量 的步骤，其使用减小的量的树脂和缓冲液，同时仍允许获得高产率的具有极佳纯度水平的 纯化抗体。纯化的蛋白质因此适用于医学应用。因此，所述方法可用于纯化蛋白质以供临 床试验和/或营销包含该蛋白质的药物组合物。另外，这种方法无需任何步骤间调节且因 此能够从待纯化的蛋白的收获直至最终产物都在闭合系统中实施。 简而言之，该方法以连续模式仅包含以下三个层析步骤：一个亲和层析、一个多模 式树脂或阳离子交换层析和一个阴离子交换层析（AEX)。这三个层析步骤可以任一顺序实 施。此外，已发现在这三个层析步骤期间所使用的所有缓冲液都可从同一母液起始而制得。 有利地，这些缓冲液包含BisTris，例如与NaCl、乙酸、水和任选地NH4C1组合。因无需任 何缓冲交换，所述方法易于实施，且高度适于自动化和/或以连续模式运行。更具体地，整 个过程可仅使用4种缓冲液，确保了所有步骤之间的兼容性且允许供应链制造和质量控制 上的节约并减小储存需要。本专利技术的方法进一步允许减少或废除开放阶段（即打开纯化系统以实施人工操 作（例如为新缓冲液准备层析柱、稀释样品或调节其pH)的步骤），由此减小污染风险并提 供了在较低等级的环境（lessclassifiedenvironment)中工作的可能性。此外，由于本 专利技术方法的每一层析步骤可使用可重复使用的树脂，或令人吃惊地可重复使用丢弃式膜吸 附剂，因此可重新开始三个层析步骤组成的序列直至获得期望的量为止，而无须人操作。具 体而言，本专利技术方法的所有层析步骤可使用可重复使用至少100次的树脂或使用可重复使 用至少50次的膜吸附剂来实施。专利技术人事实上证实了同一丢弃式膜吸附剂可在至少50次 运行的过程中使用而并不丧失稳定性。过程循环次数可由此缩短，使过程规模放大需求最 小化，且可减少操作和储存消耗，这是由于可减小树脂和缓冲液的体积且丢弃式膜吸附剂 无需在一个批次之后进行储存。因此，本专利技术的方法允许快速、成本有效地产生批料并减小 纯化系统所占据的时间，如在图10和12中可见（与图9和11相比）。其因此适于从工作 台规模放大至工业规模并纯化重组蛋白。 已针对4种不同抗体来设定和实施了具体的方案。在该方案中，使在第一层析步 骤结束时获得的粗制蛋白质洗脱液直接通过第二层析基质，具体而言通过第二层析柱或膜 吸附剂，即不经任何处理（例如pH调节、缓冲交换或稀释），且使在第二层析步骤结束时获 得的蛋白质洗脱物也直接通过第三层析基质，具体而言通过第三层析柱或膜吸附剂，即不 经任何处理（例如pH调节、缓冲液交换或稀释）。该方法示于图6中。此外，在该方案中， 将含有蛋白质的溶液以连续运行加载于第一层析基质，具体而言第一层析柱或膜吸附剂上 (参见实施例6)，在先前运行从第一层析步骤洗脱后立即开始后续运行，如在图8所见。该 方案的优点为：极其快速（一个序列约2小时），实现改进的产率（大于90%)、改进的纯 度，并允许减小在使用柱时所使用的缓冲液和树脂体积，并减少在使用膜吸附剂时所使用 的缓冲液和储存设施。另外，这种过程具有极其灵活的优点，这是由于所用柱的大小和/或 运行的数目可容易地适配于待纯化蛋白的量。此外，其可完全自动化，以连续模式运行，且 其不包含任何开放阶段。另外，其已经成功地实施于4种不同抗体而无需优化。 本专利技术由此提供从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：第一层析步骤，包含使平衡缓 冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使所述溶液通过第一层析基质具 体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜 吸附剂，使洗涤缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液 通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，和使用第一洗脱缓冲液从第一层析基 质具体而言从第一层析柱或膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液；第二层析步骤，包含使平衡 缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使粗制蛋白质洗脱液通过第二 层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，任选地使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而 言第二层析柱或膜吸附剂，和使用第二洗脱缓冲液从第二层析基质具体而言从第二层析柱 或膜吸附剂洗脱蛋白质洗脱物；和第三层析步骤，包含使平衡缓冲液通过第三层析基质具 体而言第三层析柱或膜吸附剂，使蛋白质洗脱物以流过模式（intheflow-throughmode) 通过第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，任选地使洗涤缓冲液通过第三层析基 质具体而言第三层析柱或膜吸附剂，和从第三层析基质具体而言第三层析柱或膜吸附剂的 流过液回收纯化的蛋白质。 本专利技术还提供从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：第一层析步骤，包含使平衡缓 冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使一部分溶液通过第一层析基质 具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或 膜吸附剂，使洗涤缓冲液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使平衡缓冲 液通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂，使用第一洗脱缓冲液从第一层析 基质具体而言从第一层析柱或膜吸附剂洗脱粗制蛋白质洗脱液，和任选地使卫生缓冲液(sanitationbuffer)通过第一层析基质具体而言第一层析柱或膜吸附剂；第二层析步骤， 包含使平衡缓冲液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使粗制蛋白质洗脱 液通过第二层析基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，任选地使平衡缓冲液通过第二层析 基质具体而言第二层析柱或膜吸附剂，使用第二洗脱缓冲液从第二本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种从溶液纯化蛋白质的方法，其包含：(a)第一层析步骤，包含：‑使所述溶液通过第一层析基质；‑使用第一洗脱缓冲液从所述第一层析基质洗脱粗制蛋白质洗脱液；(b)第二层析步骤，包含：‑使在步骤(a)结束时获得的所述粗制蛋白质洗脱液通过第二层析基质；‑使用第二洗脱缓冲液从所述第二层析基质洗脱的蛋白质洗脱物；和(c)第三层析步骤，包含：‑使在步骤(b)结束时获得的所述蛋白质洗脱物以流过模式通过第三层析基质；‑从所述第三层析基质的流过液回收纯化的蛋白质；其中各所述缓冲液都包含Bis Tris。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D·杜斯，C·赫梅特，L·兰德里克伯廷，B·莫茨，
申请(专利权)人：赛诺菲，
类型：发明
国别省市：法国;FR