本发明专利技术属于植物基因组工程技术领域，公开了一种基于人工tasiRNA途径的水稻RNAi骨架载体的设计、构建、制备及应用方法。所述骨架载体的T-DNA区域中RNAi核心部分由AtmiR173表达单元、miR173-ts+目标基因干扰区域融合转录单元两部分构成，通过简单的PCR扩增、酶切、连接，将目标单基因、多基因干扰区域连接进入骨架载体MCS位点，与miR17-ts形成融合转录单元，可以有效诱导水稻细胞表达异源miR173分子，人工启动水稻细胞内tasiRNA途径，针构建对目标基因生成特异性次级siRNA，针对水稻内源目标基因实现单基因、多基因的简单、快捷、高效沉默，极大拓展了基于tasiRNA途径的高效基因沉默技术策略的应用范围。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于植物基因组工程
，特别涉及一种基于人工tasiRNA途径的水 稻RNAi骨架载体构建、制备及其在水稻内源单基因沉默和多基因协同沉默中的应用。
技术介绍
RNA干扰（RNAinterference，RNAi)是一种高度保守的生物体基因表达调控机 制，通过20-30nt小分子RNA(smallRNA，sRNA)介导的基因沉默机制调控目标基因表达水 平。自20世纪90年代被发现以来，RNAi已被广泛应用到动、植物功能基因组基础研究及 应用实践中。 内源sRNA在活体细胞中广泛存，依据其生物合成特点，sRNA主要分为微小 RNA(microRNA，miRNA)及小干扰RNA(small/shortinterferingRNA，siRNA)，二者长度为 20-25nt，均由类似RNaselll的Dicer或DCL(Dicer-like，RNAaseIII家族中对双链RNA 具有特异性的酶）加工产生。它们的形成既有联系又有区别：miRNA是由具发夹结构的 pri-miRNA加工而来，而siRNA则是通过具有良好互补结构的长dsRNA(double-stranded RNA)加工形成。目前发现的siRNA种类很多，根据前体序列类型和形成机制可分为： tasiRNA(trans-actingsiRNA)、natsiRNA(naturalantisensetranscript-derived siRNAs)、hcsiRNA(heterochromaticsiRNA)、rasiRNA(repeat-associatedsiRNA)等。 目前，在植物系统中已发现多种sRNA介导的基因沉默途径，不同sRNA的生物发生 及引发基因沉默的机制均有不同。反式作用干扰小RNA(trans-actingsiRNA,tasiRNA)是 一类植物特有的siRNA，由特定miRNA剪切目标基因mRNA引发，随后通过siRNA途径形成 长度为21nt的siRNA。在拟南芥tasiRNA产生过程中，特定miRNA与对应TAS基因家族成 员mRNA进行配对（TAS1、TAS2 对应miR173 ;TAS3 对应miR390 ;TAS4 对应miR828)，并引发 mRNA切割，其中miRNA引导的切割在tasiRNA的生成过程中是不可或缺的。 现阶段，RNAi技术已成为植物功能基因研究和新品种创制的重要方法，其中针对 目标基因构建高效RNAi表达载体是其核心内容。目前，主要的植物RNAi表达载体构建方 法为：1)依据目标基因保守区设计引物分别扩增正、反向片段和通用loop环序列（通常采 用稳定的内含子区段作为通用loop单元）；2)分别酶切目标基因正、反向双链单元、对应 loop及骨架载体，进而连接、转化、鉴定。该方法需进行多步酶切、连接，过程复杂、费时费 工。 尽管为了有效提高干扰效率，进一步促进RNAi在植物功能基因组研究及种质创 新中的应用，相关研究者对植物RNAi表达系统（特别是RNAi表达骨架载体）进行了大量改 进研究。但迄今为止，植物RNAi表达载体构建及应用方案依然存在：步骤繁琐、耗时较长、 成本较高、效率不稳定等问题。特别是针对多基因位点的协同干扰任务，目前的RNAi构建 及表达系统的劣势更为突出。这些问题，极大的限制了RNAi技术在植物功能基因组研究及 基因组工程中的有效应用及实践范围。
技术实现思路
针对现有植物RNAi表达载体构建周期长、成本高、效率低、预见性差，以及难以有 效实现多基因位点协同干扰的技术缺陷，本专利技术提供了一种基于人工tasiRNA途径的水稻 RNAi骨架载体，其能够有效进行水稻内源单基因及多基因沉默，实现了水稻RNAi表达系统 的简单、快捷、高效及多目标应用。 本专利技术的技术方案是一种基于人工tasiRNA途径的水稻RNAi骨架载体，其 T-DNA区域中RNAi核心部分由AtmiR173表达单元和miR173-ts+目标基因干扰区域 (miR173-ts+G0Ifragment)融合转录单元两部分构成。 具体的，所述的AtmiR173表达单元5'-3'方向依次为启动子-AtmiR173转录 区-0CS终止子；所述启动子为CaMV35S启动子或AtUBQlO启动子。 具体的，所述AtmiR173转录区具有如SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。 具体的，所述AtmiR173表达单元的启动子为CaMV35S启动子，该表达单元具有如 SEQIDNo. 2所示的核苷酸序列。 具体的，所述miR173-ts+G0Ifragment融合单元5'-3'方向依次为启动 子-miR173-ts元件-MCS位点（多克隆位点：以便连接G0I片段）-HSP终止子；所述启动子 为ZmUbi-1启动子或CaMV35S启动子。 具体的，所述miR173-ts元件具有如SEQIDNo. 3所示的核苷酸序列。 具体的，所述miR173-ts+G0Ifragment融合单元的启动子为ZmUbi-1启动子，该 融合单元具有如SEQIDNo. 4所示的核苷酸序列。 具体的，所述的多克隆位点为ΚρηΙ和Xmal。 具体的，所述T-DNA区域中RNAi核心部分还包括潮霉素抗性基因表达单元 具体的，所述的骨架载体为PZHY932,其T-DNA区域具有如SEQIDNo. 5所示的核 苷酸序列。 另一方面，本专利技术还提供一种基于所述RNAi骨架载体构建目标基因RNAi表达载 体的方法，包括如下步骤：a、明确水稻基因组目标基因转录区域，分析具有较高系列特异性的区域；b、提取水稻相应时期RNA，反转录得到cDNA ; c、设计合成PCR引物，以相应水稻cDNA为模板，扩增150~500bp目标基因片段； d、采用多克隆位点的酶切位点分别对骨架载体及扩增得到的G0Ifragment进行 双酶切，进行片段回收、T4DNAligase连接；e、取连接反应产物转化大肠杆菌，通过细菌筛选压筛选含正确G0Ifragment连接 入载体的重组克隆，并通过菌落PCR、质粒酶切、序列测定的方法进行鉴定，构建用于水稻目 标基因沉默的RNAi表达载体。 具体的，步骤c中扩增200~300bp目标基因片段。 本专利技术还提供了所述骨架载体在水稻内源单基因、多基因沉默中的应用。 本专利技术提供了一种基于人工tasiRNA途径的水稻RNAi骨架载体，其工作原理示意 图及载体注释图谱分别如图1、2所示。其T-DNA区域中RNAi核心部分由AtmiR173表达单 元、miR173-ts+目标基因干扰区域（miR173-ts+G0Ifragment)融合转录单元两部分构成 (图 2)。 本专利技术中，ZmUbi-1启动子依次包括983bp的启动子序列和1015bp的ZmUbi-1内 含子序列，该内含子序列可用于调控下游基因的表达效率。 针对目标基因，RT-PCR扩增目标基因cDNA片段作为干扰区域，于骨架载体 PZHY932中的MIR173靶向序列进行融合构建，得到目标基因的RNAi表达载体。进行水稻转 化后，AtmiR173表达单元、miR173-ts+目标基因干扰区域融合单元分别在水稻细胞内转录 加工形成 22nt的成熟miR173 分子（5 '-uucgcuu本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于人工tasiRNA途径的水稻RNAi骨架载体，其特征在于：其T‑DNA区域中RNAi核心部分由AtmiR173表达单元和miR173‑ts+目标基因干扰区域融合转录单元两部分构成。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郑雪莲，张勇，邓科君，臧黎黎，
申请(专利权)人：电子科技大学，
类型：发明
国别省市：四川;51
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