本申请公开了通过EPO或APS引发用于制备具有改善的血管新生特性的外周血干细胞的方法及其用途。根据本申请的方法制备的细胞诱导血管新生，并因此可有效地用于需要促进血管新生的各种疾病的再生或恢复，例如肌肉、脑、心脏、肾脏或大肠中发生的缺血性疾病，例如由于缺血引起的组织损伤、脑梗塞、中风、再灌注损伤、心肌梗塞、充血性心脏衰竭、外周血管梗阻、心肌肥大、低心脏收缩、低心脏扩张、适应不良性心脏肥大、收缩期心脏衰竭、舒张期心脏衰竭、高血压性心脏衰竭、动脉或二尖瓣疾病、心脏血管合并肺动脉瓣疾病或缺血性心脏血管。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本申请涉及其能力可通过被用于需要血管形成的疾病的细胞因子动员的外周血 干细胞的体外引发过程增强的细胞以及使用相同细胞的细胞治疗产品的领域。
技术介绍
细胞治疗法主要使用都能组织再生的成体干细胞或祖细胞，并且所述方法的示例 包括试图通过使用骨髓源干细胞再生血管和肌肉。然而，未充分了解适用于用作成体干细 胞成分的细胞和组织的再生的干细胞的选择方法，并且因此在这种方法的实际使用中出现 了困难。 尽管对细胞治疗进行不断的研究，但是一直存在干细胞数目绝对不足、干细胞存 活率低等等问题。因此，需要不断的努力以使临床应用有效并使细胞治疗效率最大化。 研究实际上是在使用用于干细胞的药物（它可以防止细胞死亡）中的进展以尽可 能减少干细胞丢失、诱导干细胞分化成更适合于组织再生的其他类型的细胞等等。 缺血是指特定组织的血液供应不足的状态，导致氧气和营养物质的供应和有害代 谢物的去除不足，最终导致组织损伤。临床代表性的疾病的示例包括缺血性心血管病。对于 这样的心血管疾病的治疗的示例包括冠状动脉血管成形术，然而，尽管支架技术不断发展， 但是仍不足以恢复已经受损的组织。 因此，引人注目的治疗是使用心脏肌肉再生干细胞。 韩国未审查专利申请公开No. 2007-0054140涉及脐带血产生的多能干细胞以及 用于治疗缺血性坏死疾病的包含该干细胞的细胞治疗产品，并且它提供了用于治疗由动脉 粥样硬化动脉疾病引起的缺血性坏死病的细胞治疗产品。 细胞治疗产品的不断发展是缺血性相关疾病的根治性治疗所必需的。
技术实现思路
技术问题 本申请旨在提供用于需要血管形成的疾病的细胞治疗产品。 技术解决方案 在一个方面，本申请涉及制备具有改善的血管形成特性的经动员的外周血干细胞 (mobPBSC)的方法，其中所述方法包括提供利用细胞因子处理的人外周血；从上述血中分 离出成层的单核细胞；以及利用促红细胞生成素（ΕΡ0)或活化的血小板上清液（APS)处理 上述单核细胞。 本申请的外周血干细胞是自体的、同种异体的或异种的细胞，并且其特别是自体 细胞。 在另一个方面，本申请还提供了具有改善的血管形成特性并由本申请的方法制备 的mobPBSC〇 在另一个方面，本申请还涉及具有改善的血管形成特性并由ΕΡ0或APS活化的 mobPBSCo 在本申请中，利用EPO处理的细胞与未经处理的细胞相比较而言增加整合素β-1 和β-2的以及⑶14/⑶16的双表达，并且增加通过ΕΡ0受体迀移的IL8、IL10和FGF基因 和蛋白质的表达。此外，利用APS处理的细胞与未处理的细胞相比较而言增加IL9、IL17、 PDGF和VEGF的基因表达，增加ΕΡ0受体、〇)34、〇)31、1^2、〇乂〇?4、整合素€1-5、整合素0-1 和整合素β-2的表达以及增加⑶14/⑶16的双重表达。 本申请还提供了用于治疗缺血性疾病并包含本申请的mobPBSC的组合物。所述组 合物可有效用于治疗缺血性心脏疾病。缺血性心脏疾病的示例包括心肌梗塞、心绞痛、充血 性心脏衰竭、外周血管阻塞、心脏肥大、低心脏收缩、低心脏扩张、适应不良性心脏肥大、收 缩期心脏衰竭、舒张期心脏衰竭和高血压性心脏衰竭。 本申请的细胞具有改善的血管形成特性，并且它涉及旨在用于促进血管形成并包 含mobPBSC的组合物。 在另一个方面，本申请还涉及治疗缺血性疾病的方法，其包括向需要缺血性疾病 治疗的受试者施用根据本申请制备的细胞或包含所述细胞的组合物。 可使用本申请的治疗的缺血性疾病如上文所述。 有益效果 本申请的APS-或ΕΡ0-引发的mobPBSC诱导血管生成；因此，它们可用于需要促进 血管形成的各种疾病（例如，发生在肌肉、脑、心脏、肾脏或大肠的缺血性疾病），其示例包 括由缺血造成的组织损伤、脑梗塞、中风、再灌注损伤、心肌梗死、充血性心脏衰竭、外周血 管梗阻、心脏肥大、低心脏收缩、低心脏扩张、适应不良性心脏肥大、收缩期心脏衰竭、舒张 期心脏衰竭、高血压性心脏衰竭、动脉和二尖瓣疾病、心脏血管合并肺动脉瓣疾病或者缺血 性心脏血管再生或恢复。【附图说明】 图1示出了分离mobPBSC的过程的模拟图-其基于密度差从人血中通过细胞因 子（G-CSF)动员，然后在ΕΡ0培养液中引发干细胞。 图2示出了通过FACS法利用ΕΡ0引发的细胞因子诱导的mobPBSC的识别特征。 图3示出了在mobPBSC的细胞群体（由G-CSF动员并在ΕΡ0培养液中引发）中鉴 别血管新生相关基因和蛋白质的表达增加。还鉴别的是，作为通过ΕΡ0受体迀移的结果，随 下游JAK、AKT信号转导分子被活化而发生这样的表达增加。 图4示出了当处理mobPBSC的细胞群的细胞培养物上清液（由G-CSF动员并在 ΕΡ0培养液中引发）时改善人脐静脉内皮细胞（HUVEC)的管形成和迀移能力，并且这样的改 善通过ΕΡ0受体迀移而发生。 图5示出了mobPBSC的细胞群（由G-CSF动员并在ΕΡ0培养液中引发）显示出与 HUVEC和ECM(纤连蛋白）的粘附性更强并且这样的现象归因于整合素增加。 图6示出了当制备免疫系统受抑制的无胸腺裸小鼠的后肢缺血模型并且然后将 mobPBSC(由细胞因子动员并由ΕΡ0引发）注入小鼠时观察到优良的血管形成特性。还鉴别 的是，当21天后使用CD34 (分化簇34 (绿色）：对人类细胞具有特异性的抗体）进行后肢 组织的免疫荧光染色时，CD34是血管内皮细胞引物，将由G-CSF动员并在ΕΡ0培养液中引 发的mobPBSC引入到血管生成物中。 图7示出了在诱导小鼠心脏缺血后，当将mobPBSC(由细胞因子动员并由ΕΡ0引发 的）注入免疫系统受抑制的无胸腺裸小鼠内时，促进心脏恢复。 图8示出了利用APS引发mobPBSC的方法的示意图，相对于未活化的血小板上 清液（幼稚血小板上清液）和APS而言，分离出mobPBSC之后Giemsa染色的结果和利用 ELISA(酶联免疫吸附测定）对细胞因子进行分析的结果。 图 9 是mobPBSC被刺激（利用Veh/APS) 6 小时后RT-PCR对IL-8、IL-10、IL-13、 IL-17、bFGF、TNF-、CXCR4和EP0R(促红细胞生成素受体）的基因表达的分析结果。 图10示出了通过FACS法由Veh/APS引发的mobPBSC的识别特征。 图11示出了Veh/APS引发的mobPBSC中纤连蛋白粘附素的观察结果。 图12示出了识别趋化性和细胞迀移的实验过程的示意图，以及所观察的Veh/APS 引发的mobPBSC趋向SDF-1的趋化性结果。 图 13 示出了上清液中有关IL-8、IL-10、TNF-、IL-17、PDGF和VEGF表达的ELISA 的分析结果，其中培养Veh/APS引发的mobPBSC，以及利用上述上清液处理的HUVEC的基质 胶管道形成和迀移的分析结果。 图14示出了将Veh/APS引发的mobPBSC注入免疫系统受抑制的无胸腺裸小鼠 的缺血性后肢模型内之后灌注程度的组织学分析和测定结果，以及被注入APS引发的 mobPBSC的细胞的血管生成。 图15示出了其中将APS引发的mobPBSC注入免疫系统受抑制的无胸腺裸鼠的缺 血性后肢模型中的组比对照组更促进血管生成。 图16本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种制备具有改善的血管形成特性的外周血干细胞(mobPBSC)的方法，所述方法包括：从已利用细胞因子预处理的人采集外周血；从所述血分离出成层的单核细胞；以及利用促红细胞生成素或活化的血小板上清液(APS)处理所述单核细胞。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...
【专利技术属性】
技术研发人员：朴永培，金孝洙，姜炫在，许振，姜智薰，韩晸奎，尹智娟，崔载一，姜珍峨，
申请(专利权)人：首尔大学校产学协力团，
类型：发明
国别省市：韩国;KR
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