将dsRNA引入植物种子以调节基因表达的方法技术

提供了将外源不可转录的多核苷酸触发物例如dsRNA分子引入种子的方法。所述方法包括在允许外源不可转录的多核苷酸触发物例如dsRNA分子穿透入种子的条件下使种子与外源不可转录的多核苷酸触发物例如dsRNA分子接触，从而将外源不可转录的多核苷酸触发物例如dsRNA分子引入种子。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】将dsRNA引入植物种子以调节基因表达的方法序列表的结合名称为58066P3409812-22-2013_ST25.txt的ASCII文件于2013年12月25日创建，包含109,372字节，与本申请同时提交。专利
提供了用于改良植物对害虫的抗性的方法和组合物。也提供了用于改良植物对病毒病原体的抗性的方法和组合物。背景随着世界人口不断增加，对食物、燃料和纤维的需求日益增长以及变化万千的气候，农业面临着前所未有的挑战。非常需要研发具有改良性状的植物，其中对农民和种子公司有重大利益的一些主要性状包括改进的非生物胁迫耐受性、肥料使用效率、抗病性、产量等等。植物性状改良通常通过遗传工程或经典育种进行。非常需要通过特定的基因改变用于性状改良的新的方法。这些包括用于基因过量表达或基因沉默的方法。序列特异性基因沉默的一项强大技术是通过RNA干扰(RNAi)。RNAi最早发现于线虫秀丽隐杆线虫(C.elegans)(Fire等人，1998，Nature，391:806-811)，是其中可通过将与个别基因同源的双链RNA(dsRNA)引入细胞而使所选基因的表达特异性沉默的一种机制。在细胞内，dsRNA分子被RNA酶III相关酶(Dicer)切割成21-27个核苷酸的较短片段。这些片段，称为小干扰RNA(siRNA)，被掺入RNA诱导的沉默复合体(RISC)中。在另外的加工之后，siRNA转化成单链RNA，充当最终切割目标信使RNA的指导序列。通过使用RNAi使相关目标基因特异性沉默，可改变生物体的基本性状。特别对于植物，对可能导致高的胁迫抗性和更好的作物产量的修饰有着不可思议的潜力。在植物中，通常通过产生过量表达经转录产生dsRNA的DNA片段的转基因植物，来进行RNAi。这种dsRNA随后被加工成介导靶基因切割和沉默的siRNA。这种技术的主要技术限制是许多重要的植物作物种难以或不可能转化，阻碍了指导dsRNA产生的构建体的组成型表达。而且，有关抗病毒转基因植物的潜在生态影响的问题迄今为止严重限制了它们的应用[Tepfer,2002,Annu.Rev.Phytopathol.40,467-491]。获取转基因植物的另一个障碍归因于使转化和再生事件发生在同一细胞类型中的难度。因此开发用于获取不依赖于组织培养程序固有方法的转化种子的方法是植物分子生物学研究的前缘。专利技术概述按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供将裸dsRNA引入种子的方法，所述方法包括在允许dsRNA穿透入种子的条件下使种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供包含外源裸dsRNA的分离的种子，其中所述种子缺乏驱动dsRNA在植物中表达的异源启动子。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供包含外源裸dsRNA3的分离的种子。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供植物或植物部分，其包含外源裸dsRNA并缺乏驱动dsRNA在植物中表达的异源启动子。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供包含大量种子的含种子装置。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供包含大量种子的播种田(sownfield)。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供产生植物的方法，所述方法包括：(a)提供种子；和(b)使种子萌发以产生植物。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供调节基因表达的方法，所述方法包括：(a)在允许dsRNA穿透入种子的条件下使植物种子与裸dsRNA接触，从而将dsRNA引入种子；和任选地(b)产生种子的植物。按照本专利技术的一些实施方案，设计裸dsRNA用于下调植物基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，设计裸dsRNA用于下调植物病原体基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，穿透是进入种子的胚乳并且备选地或另外地进入种子的胚中。按照本专利技术的一些实施方案，裸dsRNA不整合到种子的基因组。按照本专利技术的一些实施方案，所述条件导致在萌发后dsRNA存在于植物中至少10天。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供抑制植物病原性生物的靶基因的表达的方法，所述方法包括向植物病原性生物提供植物或植物部分，从而抑制植物病原性生物的靶基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，所述植物病原性生物选自真菌、线虫和昆虫。按照本专利技术的一些实施方案，所述方法进一步包括在提供后观察所述植物病原体的死亡或生长抑制。按照本专利技术的一些实施方案的方面，提供将裸dsRNA引入种子的试剂盒，其包括：(i)裸dsRNA；和(ii)引发溶液(primingsolution)。按照本专利技术的一些实施方案，裸dsRNA和引发溶液装在分开的容器中。按照本专利技术的一些实施方案，dsRNA包含siRNA。按照本专利技术的一些实施方案，dsRNA包含siRNA和dsRNA。按照本专利技术的一些实施方案，接触是通过用dsRNA接种种子来实行。按照本专利技术的一些实施方案，所述方法进一步包括在接触前引发种子。按照本专利技术的一些实施方案，所述引发如下实行：(i)在所述接触前洗涤种子；和(ii)在步骤(i)后干燥种子。按照本专利技术的一些实施方案，在双重去离子水存在下实行洗涤。按照本专利技术的一些实施方案，实行洗涤2-6小时。按照本专利技术的一些实施方案，洗涤在4-28℃下实行。按照本专利技术的一些实施方案，干燥在25-30℃下实行10-16小时。按照本专利技术的一些实施方案，在终浓度为0.1-100μg/μl的裸dsRNA存在下实行接触。按照本专利技术的一些实施方案，在终浓度为0.1-0.5μg/μl的裸dsRNA存在下实行接触。按照本专利技术的一些实施方案，所述方法进一步包括在接触后用作用剂处理种子，所述作用剂选自杀虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、肥料、涂布剂和着色剂。按照本专利技术的一些实施方案，所述处理包括用作用剂涂布种子。按照本专利技术的一些实施方案，种子不含选自杀虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、肥料、涂布剂和着色剂的作用剂。按照本专利技术的一些实施方案，dsRNA用于下调编码基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，dsRNA用于下调非编码基因的表达。按照本专利技术的一些实施方案，种子是绿色植物界(Viridiplantae)总科的。按照本专利技术的一些实施方案，所述条件允许dsRNA在种子的胚乳中蓄积以及备选地或另外地在种子的胚中蓄积。按照本专利技术的一些实施方案，按照选自以下的参数调节裸dsRNA的浓度：种子大小、种子重量、种子体积、种子表面积、种子密度和种子透性。按照本专利技术的一些实施方案，接触在打破种子休眠和胚出现之前实行。按照本专利技术的一些实施方案，种子是经引发的种子。按照本专利技术的一些实施方案，种子或植物包含扩大dsRNA表达的RNA依赖性RNA聚合酶活性。按照本专利技术的一些实施方案，种子是杂种种子。按照一些实施方案，提供包含核酸序列的分离的dsRNA，所述核酸序列：(i)与植物基因具有足以在包含它们的植物细胞中诱导dsRNA的次级siRNA产物的扩增的同源性水平并且其中所述dsRNA对植物基因的下调基本上不影响所述植物的任何生物量、生长势或产量；和(ii)与植物病原性生物基因具有足以诱导所述植物病原性生物的所述基因降解的同源性水平，其中所述植物病原性生物的生长依赖于所述植物并且其中所述降解诱导所述植物病原性生物的生长停滞或死亡。按照一些实施方案，所述核酸序列的长度为至少2本文档来自技高网...

【技术保护点】
提供具有改良的害虫抗性的植物的方法，包括：自种子长出植物，其中所述种子已经接触包含以下序列的外源dsRNA分子：所述序列与害虫基因或自所述基因转录的RNA序列的至少18个连续核苷酸基本相同或与其基本互补，其中相比对照植物，所述植物表现出改良的害虫抗性，其中所述对照植物自未接触所述外源dsRNA分子的种子长出。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2013.01.01 US 61/748095;2013.01.01 US 61/748094;201.用于产生具有昆虫抗性的植物的方法，所述方法包括：a)将未萌发的分离的种子浸泡在包含不可转录的dsRNA分子的溶液中，所述dsRNA分子含有包含呈反义或有义方向的害虫基因的18或更多个连续核苷酸的至少一个区段的至少一个多核苷酸链，其中在所述溶液中振荡所述未萌发的分离的种子达至多24小时，和b)使分离的种子萌发以产生自分离的种子显现后表现出昆虫抗性的植物。2.权利要求1的方法，其中在自分离的种子显现后所述植物不包含可检测水平的所述dsRNA分子。3.权利要求1的方法，其中所述害虫基因选自ATP酶、NADPH细胞色素P450氧化还原酶、IAP、壳多糖合酶、EF1α和β-肌动蛋白。4.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述植物对棉贪夜蛾、玉米幼芽根叶甲或马铃薯甲虫侵染具有抗性。5.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述不可转录的dsRNA分子与内源植物基因在至少25个连续bp上具有至少80%同一性。6.权利要求1-3中任一项的方法，其中所述方法进一步包括在引入不可转录的dsRNA分子之前引发分离的种子。7.权利要求6的方法，其中所述引发如下实行：(i)在引入不可转录的dsRNA分子之前洗涤分离的种子；和(ii)在步骤(i)之后干燥分离的种子。8.处理分离的种子以改良自分离的种子长出的植物的昆虫抗性的方法，所述方法包括：将未萌发的分离的种子浸泡在包含含有以下序列的外源dsRNA分子的溶液中：所述序列与害虫基因或自所述害虫基因转录的RNA序列的至少18个连续核苷酸基本相同或与其基本互补，其中在所述溶液中振荡所述未萌发的分离的种子达至多24小时，并且其中相比对照植物，所述自所述未萌发的...

【专利技术属性】
技术研发人员：A阿夫尼伊，E里多尼里，R毛尔，O梅尔，O奈维特布里克，
申请(专利权)人：AB种子有限公司，
类型：发明
国别省市：以色列;IL