本发明专利技术涉及纯化核酸的方法、实施本发明专利技术方法的试剂盒以及磁性颗粒用于纯化生物试样的新用途。本发明专利技术方法包括以下步骤：将第一试样容器中的试样收集在水溶液中，并在非离液序列高的条件下裂解该试样；将第一磁性颗粒悬浮在该溶液中，并将第一试样容器引入试样容器夹持器中，其中将该试样容器引入与该试样容器夹持器相关联的环形磁铁的环内部空间中；将溶液与磁性颗粒分开；并从溶液中分离核酸。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】 本申请是申请号为200980149742. 8的中国专利申请（国际申请日：2009年11月 20日，国际【申请号】PCT/EP2009/065534,专利技术名称：纯化核酸、特别是来自固定组织的核酸 的方法）的分案申请。 本专利技术涉及纯化核酸的方法、实施本专利技术方法的系统以及用于纯化生物试样的试 样容器夹持器。 近来，分子诊断学的重要性日益增加。分子诊断学已经开始应用于临床诊断疾病 (其中包括检测感染病原体，检测基因变异，发现循环肿瘤细胞和鉴别疾病遗传因素的风险 因子等）。但是，分子诊断学的方法同时也应用于兽用药、环境分析和营养物质测试中。另 一应用领域为在病理学/细胞学研究所的研究或者在法医询查范围内的研究。同时在保健 领域（例如研究库存血的感染病原体-自由度（Infektionserreger-Freiheit))也使用基 因诊断学，立法者计划在将来用法律规范这些测试。在临床分子诊断学中应用的方法（如 杂交或扩增技术如PCR(聚合酶链式反应），TMA(转录介导的扩增），LCR(连接酶链反应）、 bDNA(分支DNA)或NASBA(基于核酸序列的扩增）-技术）在基础科学研究工作中也属于常 规方法。 特别地，核酸分析通过确定组织中的基因表达在肿瘤疾病的研究和诊断中开启了 充满前景的新的可能性。因此，例如，所谓微阵列系统已经开启了在单个反应装置中确定 上百或甚至上千个基因表达的可能性。将试样材料、纯化的核酸（如RNA或CDNA)施用至 芯片，该芯片包括相应的捕捉寡聚核苷酸，从而该试样中的核酸可以通过杂交而被检测。此 外，其他在试样中检测核酸的方法，例如扩增方法如聚合酶链式反应（PCR)，也是普遍使用 的。 核酸分析中的基本问题是试样制备。待研究的试样通常包括含干扰性、部分不可 溶的成分（所谓的碎片（Debris))的细胞或组织，这些成分会干扰后续的分离和分析。这 些不可溶的成分特别出现在从粪便/排泄物、血液、疣、钙化组织（骨）或其他严重坏死组 织中分离核酸时。然而，碎片在其最广泛意义上也包括可溶性成分，例如从红细胞释放的血 红蛋白，其严重过量的存在，并且会在分离核酸期间除去。 特别是在肿瘤诊断学中这些问题加剧严重，因为此时常常使用甲醛固定的、石蜡 包埋的切片（formalin-fixedparaffin-embedded,FFPE-Schnitte)作为试样材料。当如 在活组织检查期间从患者取试样时，或者在外科手术中取肿瘤物质的试样时，组织材料用 甲醛固定，并包埋入石蜡中，从而可以保存该试样材料。在培育期间，同样之后在组织块 (Gewebeblock)中的多年，固定接（Fixantien)造成生物分子的严重交联（核酸与蛋白质， 蛋白质彼此之间，或核酸彼此之间）。这些交联结构的内部和外部细胞有助于生成不溶性碎 片，或不可裂解或难以裂解的碎片。通常从这些包埋在石蜡中的试样制备切片供病理学家 评估；然而，这些切片同样能够用作核酸分析中的起始材料。在这种情况中，细胞碎片和石 蜡必须在裂解后的核酸纯化期间被除去。 此外，涉及干扰性的、部分不溶性成分（碎片）的问题也会在纯化来自粪便试样 (排泄物、粪便（Kot))期间发生。粪便试样不仅包括食物的难消化成分（粗粮），还包括未 消化的剩余物，如脂肪、淀粉、结缔组织纤维和肌肉纤维和水，它们在大肠的上部不被吸收。 存在的内源物质包括：脱落的肠细胞、消化酶的剩余物和粘液。此外，少量的胆汁本身、以及 也会从胆囊排出以保护肠粘膜的少量的卵磷脂以及少量的其他磷脂会随动物粪便一起排 出。 为了降低成本并保持从试样制备到测定分析结果的时间尽可能短，重要的目的是 使纯化核酸的方法尽可能有效，并且尽可能通过自动化手段实施该方法。这特别适用于诊 断学。高度适于自动化的方法是那些能够在尽可能少的不同反应容器中进行的并可以以标 准化形式（例如，96孔板形式）进行的方法，因为可以在该方法中使用高效的移液自动装 置。因此，在现有技术中存在对简单、高效和高度自动化的试样制备方法的需求。 常见的核酸纯化方法包括在离液序列高的条件下裂解试样、提取纯化、沉降和从 液相例如苯酸 _氯仿提取液纯化（参见Sambrook等人，Molecularcloning-alaboratory manual,第三版，ColdSpringHarborLaboratory,ColdSpringHarborPress, 2001,IS BN-13:978-0879695774)，或基于柱的纯化方法，如在W0 2003040364-A1中记载的。 常见的分离核酸的方法已经披露于Chomczynski(US5, 346, 994)中，并且包括基 于使用苯酚和离液序列高的化合物异硫氰酸胍从液相分离而从组织材料纯化核酸的方法。 该试样必须在水溶液中被匀浆化，在加入异硫氰酸胍（GTC)和苯酚/氯仿后进行离心。蛋白 质存在于有机相中，DNA存在于相间，RNA存在于水相中。RNA可以从水相中沉淀出来。然 而，该方法不能可靠地从FFPE组织试样纯化RNA。 其他已知的DNA或RNA分离方法通常使用离液序列高的盐或苯酚提取液。 EP0819696公开了一种纯化核酸的方法，其基于在离液序列高的条件下将核酸结 合至氧化硅（Silika)或其他二氧化硅衍生物。该试样在离液序列高的裂解缓冲液中发生 裂解，并且核酸结合至二氧化娃基质（Silikamatrix)。 现有技术中已知的由石錯切片（Paraffinschnitten)纯化核酸的方法首先需要 繁琐的去石蜡化，其中，石蜡通常通过二甲苯除去，并且接着繁琐的用二甲苯/乙醇稀释序 列进行再水化作用（Rehydratisierung)。 例如，W0 200146402A1记载了一种从固定的石蜡切片纯化RNA的方法，其中首先 将石蜡切片置于Eppendorf反应容器中，并用二甲苯去石蜡。接着切片必须用二甲苯/乙 醇稀释系列（VerdUnnungsreihe)进行再水化作用。接着，将试样在离液序列高的溶液中长 时间（5至120分钟）加热以纯化RNA。尽管该方法实现了有效的去石蜡化，但是其为繁琐 的，并且由于需要多次离心步骤，不是非常适用于自动化。 此外，EP1510577还披露了一种方法，其中在离液序列高的条件下核酸结合至磁性 颗粒，并且能够通过施加磁场从试样上清液中分离。W0 1990 014 891A1披露了一种磁性试 样夹持器，其可以用于该目的。然而，在该方法中，不存在在非离液序列高的条件下预先纯 化试样中的细胞碎片或去石蜡化。但是，在纯化核酸时，碎片在试样中的存在具有不利的作 用，在自动化方法中是特别不利的，因为碎片会堵塞移液管尖、抽吸管等，并且还会损坏用 于监控移液步骤的压力传感器。 因此，考虑到现有技术，存在对改进的纯化核酸方法的需要，特别是对适于自动化 的方法的需要。 定义 术语"生物试样"是指包含细胞或细胞材料的任何试样，特别是细胞，冻干 细胞，固定细胞，排泄物/奠便，暗黄覆盖层（buffycoat，血液的白细胞部分），腹 7K，棉签（Abstriche)，特别是颊棉签或咽喉棉签，但是更优选是颈棉签，痰，器官斑点 (Organpunktate)，精子，组织试样，固定组织试样，固本文档来自技高网...
【技术保护点】
用于纯化生物试样的核酸的自动化系统，包括：‑用于至少一个试样容器的支架；‑可温控装置，其具有至少一个用于试样容器的槽；‑试样容器夹持器，用于接收至少一个试样容器；‑用于将试样容器夹持器从支架输送到可温控装置的设备；‑用于将液体从试样容器转移出和/或转移入试样容器的装置；‑用于控制输送装置、液体转移装置和用于控制可温控装置的温度的控制装置；其中所述用于接收至少一个试样容器的试样容器夹持器具有至少一个环形磁铁，在该环形磁铁的环内部空间中可以接收试样容器。
【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：海克尤廷，吉多亨宁，亚历山大伊兹梅洛夫，
申请(专利权)人：西门子保健诊断股份有限公司，
类型：发明
国别省市：美国;US
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