一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法技术

本发明专利技术公开了一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法，采用重组DNA技术将唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LMG14476的胆盐水解酶基因克隆连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8148，并转化至Lactococcus lactis NZ9000，经筛选鉴定得到具有胆盐水解酶活性的重组乳酸乳球菌。该菌株胆汁耐受能力比野生菌提高了近5倍。采用本发明专利技术方法构建出的具有胆盐水解酶活性的乳酸乳球菌可作为具有降低血清胆固醇功能的益生菌制剂的模式菌株，应用于医药、食品领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及，属于基因工程

技术介绍
乳酸菌（LAB)作为益生菌，在工业、农业和医学等领域与人类生活密切相关，是一 类在食品中应用最广泛的重要的工业菌株，能够作为活的载体在食品或体内传递感兴趣的 蛋白。其中，LAB的模式菌株Lactococcus lactis及常用的nisin控制的食品级诱导表达 系统 NICE(nisin controlled gene expression system)为 LAB 在食品、医药工程及其改 良方面的应用提供了可能。 然而，乳酸菌为了有效发挥益生功能，必须耐受来自宿主胃肠道环境的各种生理 化学屏障以提高其肠道定植能力。其中，胆汁胁迫是乳酸菌面临的重要挑战之一。结合胆 盐是胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合并以钠盐或钾盐形式存在的一类重要的胆汁组分，其在 脂肪的乳化和增溶中发挥着必不可少的作用；同时，结合胆盐的双亲性使其具有扰乱细胞 膜脂质双分子层的特性，从而干扰细胞稳态而呈现出抗菌性。 胆盐水解酶（BSH)是由bsh基因编码的一种胞内酶，广泛存在于肠道微生物中，能 够水解肠道内的结合态胆盐形成氨基酸和游离胆汁酸。其功能体现在两个方面：一、对人类 宿主的作用。由于经BSH作用后产生的游离胆汁酸会与肠道中的钠盐/钾盐形成去结合型 胆盐，该去结合型胆盐比水解前的结合态胆盐重吸收效率降低，从而会随粪便排出，而胆固 醇的主要去路是转变成结合胆盐，因此通过BSH的水解作用可以使胆固醇不断向合成结合 胆盐的方向进行以保证肠道内结合胆盐与脂质物质的平衡，从而消耗体内更多的胆固醇， 达到降低血清胆固醇的目的。二、对微生物的作用。BSH是肠道微生物为了抵抗胆盐得以生 存而产生的一种代谢产物；经BSH作用形成的氨基酸既可以作为营养物质被菌体利用，又 能够解除结合胆盐的毒害作用，提高益生菌的胆汁耐受能力及肠道定植能力。 因此，运用基因工程手段获得携有BSH活性的乳酸菌菌株可以为研究BSH作用于 菌体自身和宿主提供技术平台，也为应用口服活菌细胞疗法控制人体血清胆固醇水平提供 了一种有效提高菌体细胞胆汁耐受和肠道定植能力的技术方法。
技术实现思路
本专利技术提供了两株胆汁耐受能力提高了的乳酸乳球菌，是将含有编码胆盐水解酶 的基因导入乳酸菌得到的两株基因工程菌。 所述胆盐水解酶基因为bshl和bsh2 ;bshl基因序列如SEQ ID NO. 1所示；bsh2 基因序列如SEQ ID NO. 2所示。 所述乳酸菌为乳酸乳球菌。 所述胆盐水解酶优选bshl。 本专利技术所要解决的另一个技术问题是提供一种增强乳酸乳球菌胆汁耐受能力的 方法，包括如下步骤： 1)设计引物以LMG14476的基因组DNA为模板扩增出bshl和bsh2基因； 2)将bshl和bsh2基因分别连接到乳酸乳球菌表达载体pNZ8148,得到重组载体； pNZ8148-bshl和 pNZ8148-bsh2 3)重组载体转化至 Lactococcus lactis NZ9000。 所述引物根据NCBI网站报道的Lactobacillus salivarius LMG14476中胆盐水 解酶BSH1和BSH2的基因序列设计，引物序列如下： bshl-F(SEQ ID NO. 3)： 5' -ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGGTA-3' bshl-R(SEQ ID NO. 4)： 5 ' -GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTT-3 ' bsh2-F(SEQ ID NO. 5)： 5' -ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTGTACAGCAATTACTTTAAATGG-3' bsh2-R(SEQ ID NO. 6)： 5 ' -GAAAGCTTGAGCTCTCTAGATTAATTCAACTTATTTATTATTTGTTTTCTTT-3 ' 参照KOD-Plus-Neo试剂盒说明书配制PCR反应体系；PCR扩增条件为：95°C预变 性5!1^11 ;95°(：变性3〇8,45°(：退火6〇8,68°(：延伸11^11，5个循环；95°(：变性3〇8,55°(：退火 60s，68°C延伸 lmin，25 个循环；68°C延伸 10min。 利用同源重组酶Exnase II将胶回收纯化后的PCR产物连接到乳酸乳球菌表达 载体 pNZ8148,得到重组载体 pNZ8148_bshl 和 pNZ8148_bsh2,分别转化至 Lactococcus lactis NZ9000,经筛选鉴定获得重组菌 Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148_bshl 和 Lactococcus lactis NZ9000-pNZ8148_bsh2。 胆盐水解酶酶活测定方法：收集菌体，用0. 1M磷酸盐缓冲液（pH 6. 0)洗涤离心2 次，调整菌浓在600nm下吸光度为5。取lmL上述细胞悬浊液，超声破碎7min (工作时间：间 歇时间=2:4)，离心收集上清液。取10 μ L上清液用0. 1M磷酸盐缓冲液（pH 6. 0)稀释至 90 μ L，加入10 μ L结合胆盐（200mM)混合，于37°C孵育30min，加入等体积的15% (w/v)三 氯乙酸终止反应，离心后取10 μ L上清液与190 μ L茚三酮试剂混合，于100°C反应15min， 冷却后于570nm处测定吸光值，根据甘氨酸标准曲线进行计算。其中，茚三酮试剂的组成 为：0· 5mL 1 % (w/v)茚三酮（溶解于0· 5M、ρΗ5· 5柠檬酸盐缓冲液），1. 2mL甘油，0· 2mL 0. 5M、pH5. 5的柠檬酸缓冲液。 菌体细胞胆汁耐受性的测定方法：诱导4h的菌体细胞（菌体0D_nni值约为2. 0) 按4% (w/v)接种量转接至含有0. 1% (w/v)猪胆盐和5ng/mL(w/v)的GM17培养基中，于 30°C静置培养，间隔一定时间测定菌体浓度（0D_nni值），制作生长曲线。 本专利技术的有益效果是具有BSH1和BSH2活性的基因工程菌比野生菌的胆汁耐受能 力分别提高了近5和4倍，为开发具有较高胆汁耐受能力的益生菌制剂奠定了基础。【附图说明】 图1 :目的基因的扩增。M :DL 2, 000 DNA Marker ;泳道1和泳道2 :bshl和bsh2 基因的PCR扩增条带。图2 :蛋白电泳（SDS-PAGE)实验结果。Μ :蛋白质分子量标准；1 :含有pNZ8148的 L. lactis NZ9000野生菌株细胞提取液；2 :经过Nisin诱导后的重组菌的细胞提取液。 图3 :重组菌中BSH对甘氨脱氧胆酸钠（⑶CA)和牛磺脱氧胆酸钠（TDCA)的活性 检测。 图4 :重组菌与野生菌株胆汁耐受能力的比较。【具体实施方式】 实施例1重组菌的构建及鉴定 1)从唾液乳酸杆菌Lactobacillus salivarius LMG14476提取基因组DNA作模 板，进行PCR扩增，引物为： bshl-F : 5' -ATTATAAGGAGGCACTCACCATGTG当前第1页1 2 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种增强乳酸菌胆汁耐受能力的方法，其特征在于：将胆盐水解酶基因在乳酸乳球菌中进行表达。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘松，陈坚，堵国成，毕洁，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32