本发明专利技术涉及一种蛋白G金黄色葡萄球菌肠毒素试剂盒及其制备方法，采用蛋白G预处理酶标板，结合ELISA双抗夹心法实现对金黄色葡萄球菌肠毒素A/B的快速准确检测。本试剂盒由96孔酶标板、蛋白G重组蛋白抗金黄色葡萄球菌肠毒素A单克隆抗体、抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体、含辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌肠毒素抗体酶标物、样本稀释液、洗涤液、终止液组成。本发明专利技术可快速有效的检测待检样本中苏丹红残留水平，还具有操作简单、特异性好、灵敏度高等特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种包被蛋白G的金黄色葡萄球菌肠毒素的ELISA检测试剂盒，属于 金黄色葡萄球菌肠毒素的快速检测领域。
技术介绍
金黄色葡萄球菌肠毒素 （SEs)是由金黄色葡萄球菌分泌的，能刺激中枢神经系统 引起中毒反应，是食物中最重要的细菌性毒素，同时具有"超抗原"作用，可激活免疫系统。 SEs分子量26~30kDa，易溶于水和盐溶液，其性质稳定，许多蛋白质酶均不能将其消化，并 且十分耐热，用巴氏消毒法或一般的蒸煮方法均不能将其破坏。除了早已被鉴定出的SEA、 SEB、SEC、SED、SEE等最主要的5种血清型外，近年来还发现了 SEF、SEG、SEH、SEI、SEJ、SEK、 SEL、SEM、SEN、SEO、SEP、SEQ、SER等血清型。其中由SEA-SEE引起的食物中毒占由金黄色 葡萄球菌导致的食物中毒的95%。 其中金黄色葡萄球菌肠毒素A、B是最受关注的肠毒素，据我国食品污染物和食源 性疾病监测网在2003~2005年调查数据显示，由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的微生物食源 性疾病居第4位，其中以金黄色葡萄球菌肠毒素A引起的食物中毒最多，B型次之，C型及D 型少见。A型肠毒素引起食物中毒发生率最高，B型肠毒素的毒性最强，检测这两种肠毒素 对于进行食品安全检测，预防食物中毒深有意义。 为确保临床病因的诊断和食品的卫生安全，金黄色葡萄球菌及肠毒素A、B (SEA、 SEB)的检测方法也一直在发展，目前已有的检测方法有动物检测法、放射免疫法、聚合酶链 反应、基因探针、超抗原技术、反向乳胶凝集、免疫印迹技术等。但这些方法有些方法存在灵 敏度低，特异性不强，有些存在检测局限性，检测成本昂贵等缺点，不易于推广使用。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种包被蛋白G的金黄色葡萄球菌肠毒素的ELISA检测试 剂盒，这种方法灵敏度高，准确度好，操作简便。使用蛋白G预处理酶标板，可快速有效的 检测待检样本中金黄色葡萄球菌肠毒素残留水平。基于ProteinG和IgG的特殊亲和力， ProteinG与抗体Fc片段结合后，Fab片段伸展在外，更容易抓取抗原。直接用抗体包板， 抗体在板上的结合方向是随机的，而proteinG板上的抗体具有一致方向性，抗体利用率更 尚。 本专利技术试剂盒包含：96孔酶标板、蛋白G重组蛋白、抗金黄色葡萄球菌肠毒素A单 克隆抗体(抗SEA抗体)、抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体(抗SEB抗体)、含辣根过氧 化物酶标记的金黄色葡萄球菌肠毒素抗体酶标物、样本稀释液、洗涤液、终止液。 蛋白G是经过基因优化后在大肠杆菌中重组表达的蛋白。 包被液为碳酸盐缓冲液，0.05M pH9.6 CB。 ELISA 封闭液为含 5% BSA 的 0· 05Μ ρΗ9· 6 CB。 样本稀释液为0· 05% Tween-20的1%明胶/PBS。 洗涤液为含 0· 05% Tween20 pH 为 7· 4 的 0· 01M PBS 溶液。 终止液为含 lmol/L H2S04〇 ELISA检测方法的建立： 1) 包被ELISA板： 首先用包被液将蛋白G稀释到0. 1~1 μ g/ml，100 μ 1/孔；包被到ELISA微孔板内，37°C 孵育2h ; 洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液（PBST)洗涤板孔，200~400 μ 1/孔，洗涤2 次； 再用10mM pH7. 4 PBS缓冲液将抗SEA抗体稀释到0. 01~1 μ g/ml，100 μ 1/孔；分别包 被到ELISA微孔板内，37°C孵育0. 5h ; 2) 洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液洗涤板孔，200~400 μ 1/孔，洗涤2次； 3) 封闭：100~200 μ 1/孔封闭液，37°C孵育2h ; 4 )干燥：取出酶标板甩掉板内液体，排干，37 °C烘干3h ; 5) ELISA反应：每孔加入100 μ L样品或标准品，室温静置lh，用洗板液洗涤4次，再加 入100 μ L的酶标抗体，室温静置lh，用洗板液洗涤4次； 6) 显色：每孔加入反应底物150 μ L，室温避光反应15min。每孔加入50 μ L终止液中 止反应。 7)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔0D值。 SEB双抗体夹心法的建立同SEA。 由于采用上述技术方案，本专利技术除特异性强、灵敏度高、精确性和准确性高、操作 简便等优点，还可提高抗体的利用率，节省包被抗体的用量。【附图说明】 附图1、SEA试剂盒的标准曲线图。 附图2、SEB试剂盒的标准曲线图。【具体实施方式】 具体实施例1、金黄色葡萄球菌肠毒素A ELISA试剂盒检测方法的建立 1、SEA抗体的制备 用金黄色葡萄球菌肠毒素A免疫Balb/c小鼠，将抗原和等量弗氏完全佐剂混合，免疫 剂量为10 μ g/只小鼠，背部、腹腔和足底多点注射，初次免疫30d后，每隔14d免疫一次，免 疫6次后，取尾血进行检测。免疫双扩散法测定血清中抗体效价。然后将抗原和等量弗氏 不完全佐剂混合，进行融合前最后一次加强免疫。取脾脏细胞和骨髓瘤细胞进行融合，克隆 筛选制备抗SEA单克隆抗体。 2、mAb的纯化及鉴定 采用常规的亲和层析法纯化mAb腹水，BCA法测定抗体的浓度，用十二烷基磺酸钠-聚 丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE)进行纯度的分析。 3、酶标抗体的制备 纯化的抗SEA抗体，经过过碘酸钠法标记HRP，加甘油于-20 °C保存。 4、SEA ELISA双抗夹心法的建立 1) 包被ELISA板： 首先用包被液将蛋白G稀释到0. 1 μ g/ml，100 μ 1/孔；包被到ELISA微孔板内，37°C孵 育2h ; 洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液（PBST)洗涤板孔，200 μ 1/孔，洗涤2次； 再用10mM pH7. 4 PBS缓冲液将抗SEA抗体稀释到0. 05 μ g/ml，100 μ 1/孔；分别包被 到 ELISA微孔板内，37°C孵育0. 5h ; 2) 洗板：取出酶标板甩掉板内液体，用洗涤液洗涤板孔，200 μ 1/孔，洗涤2次； 3) 封闭：100 μ 1/孔封闭液，37°C孵育2h ; 4 )干燥：取出酶标板甩掉板内液体，排干，37 °C烘干3h ; 5) ELISA反应：每孔加入100 μ L样品或标准品，室温静置lh，用洗板液洗涤4次，再加 入100 μ L的酶标抗体，室温静置lh，用洗板液洗涤4次； 6) 显色：每孔加入反应底物150 μ L，室温避光反应15min。每孔加入50 μ L终止液中 止反应。 7)读数：用酶标仪在主波长450nm，次波长630nm下检测，测定每孔0D值。 具体实施例2、SEB EL1SA双抗夹心法的建立 5、标准曲线的制作 标准品SEA浓度为：0、l、2、4、8、16ppb，对应的吸光度值为(λll、(λ 302、(λ 689、L 208、 1. 655、1. 988。标准曲线的横坐标为标品浓度，纵坐标为吸光度值。，相关系数R2=0. 9998。 6、蛋白G的SEA的ELISA检测技术重复性检测结果 样本加标2ppb SEA标准品，11份样品进行提取和检验，结果如下：11次重复测量的均值为1. 99ppb，方差（SD) 0.本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种蛋白G金黄色葡萄球菌肠毒素试剂盒及其制备方法，其特征在于：本试剂盒由96孔酶标板、蛋白G重组蛋白抗金黄色葡萄球菌肠毒素A单克隆抗体、抗金黄色葡萄球菌肠毒素B单克隆抗体、含辣根过氧化物酶标记的金黄色葡萄球菌肠毒素抗体酶标物、样本稀释液、洗涤液、终止液组成，其中酶标板为蛋白G预处理过的酶标板。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：王莹，张彦明，
申请(专利权)人：北京华安麦科生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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