本发明专利技术建立了一种线粒体tRNAThr 15909A>G突变检测方法及其试剂盒。所述方法包括DNA的提取、特异性引物设计、特异性条带PCR扩增、专一性限制性内切酶HpyCH4V酶切、琼脂糖凝胶电泳鉴定等。位于线粒体tRNAThr 15909A>G突变的DNA样本经特异性PCR扩增后含有可被专一性限制性内切酶HpyCH4V特异性识别的TGCA回文结构，进而进行快速酶切为两个小片段，经琼脂糖凝胶电泳后跑出两条带。本发明专利技术还提供检测线粒体tRNAThr 15909A>G突变检测试剂盒。本发明专利技术有检测所需仪器要求低、所需试剂成本小、用所需方操法作稳简定、单易快速掌、握、准所确，特异性好等优点。本发明专利技术有利于建立线粒体tRNAThr突变完善的筛查技术，可广泛推广于临床检测。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于线粒体tRNA突变检测领域，尤其涉及一种线粒体tRNAThl!5909A>G突 变检测方法、试剂盒及其应用。
技术介绍
心血管疾病是全球造成死亡的首要原因，据世界卫生组织统计，2008年约有1730 万人死于心血管病，到2030年，几乎有2330万人将死于心血管病，而高血压是心血管疾病 的首位危险因素。高血压影响全世界超过三分之一的成年人，即大约10亿人，每年造成全 世界900多万人死亡，其中半数死于心脏病和中风，高血压还可引起肾衰竭、盲症、血管破 裂以及脑损伤。高血压按照发病原因可以分为原发性高血压和继发性高血压，原发性高血 压约占所有高血压的90-95%。 线粒体是一种由两层膜包被的细胞器，是细胞内氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷 (ATP)的主要场所，为细胞的活动提供能量，所以有"细胞动力工厂"之称。除了为细胞供能 外，线粒体还参与如细胞分化、细胞信息传递和细胞凋亡等过程，并拥有调控细胞生长和细 胞周期的能力。 线粒体基因是人体内唯一的核外遗传物质。线粒体tRNA基因突变是与原发 性高血压相关的突变热点区域，2009年GuanMX等人发现，位于线粒体tRNATto基因 4435A>G突变与原发性高血压相关（YuqiLiu，Min_XinGuanetal.Hypertention，2009; 53:1083-1090)，2011年又进一步在细胞功能水平证明线粒体tRNAThf基因4435A>G可能影 响原发性高血压的发生发展（ZhongqiuLu，Min_XinGuanetal.EurJHumGenet，2011 ; 19:1181-1186)〇 目前对于线粒体tRNAi15909A>G突变的检测方法为第一代基因测序技术，但此 技术对仪器要求高，操作繁琐且成本昂贵，结果误差大、敏感性差并且存在放射性核素污 染；近年来，变性高效液相色谱（DHPLC)和基因芯片的应用为线粒体tRNATto 15909A>G突变 检测提供了思路，检测技术灵敏度和特异度均较高，自动化程度高，适合高通量检测，但涉 及仪器昂贵，需专人操作，不适合广泛推广。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供一种线粒体tRNATto 15909A>G突变方法，通过酶切法 进行的线粒体tRNAi15909A>G突变检测，克服了现有方法耗时长、操作难、成本高等缺点， 提供线粒体tRNATto 15909A>G突变检测试剂盒，以及上述方法或上述的试剂盒在检测与线 粒体tRNATto 15909A>G突变检测突变中的应用。 -种检测线粒体tRNATto 15909A>G突变的方法，其包括如下步骤： (1)提取全基因组DNA; (2)设计特异性引物：根据人类线粒体基因剑桥参考序列（HumanMitochondrial DNARevisedCambridgeReferenceSequence，GenBank登陆号：NC_012920.1)在 15909位 点前后345bp和183bp处设计上游引物15909F(序列号：5'-TATTTCCTATTCGCCTAC-3'）、下 游引物 15909R(序列号：5' -TACATAGCGGTTGTTGAT-3'）； (3)特异性条带PCR扩增； (4)专一性限制性内切酶HpyCH4V酶切：所述专一性限制性内切酶HpyCH4V特异 性的识别TGCA回文结构，tRNATto 15909A>G突变后，产生限制性内切酶HpyCH4V识别的TGCA 回文结构，快速酶切； (5)突变鉴定：将酶切后的产物进行凝胶电泳。 所述步骤（1)提取全基因组DNA步骤包括针对采样方式、样本来源以及样本形式 的不同选择相应的方法进行预处理。 所述步骤⑴提取全基因组DNA优选步骤如下：用细胞裂解液和溶液I对所述经 预处理得到的样本进行消化裂解，再用酚-氯仿-异戊醇沉淀DNA，用乙醇清洗有机溶剂，最 后用溶液II溶解DNA后于-20°C保存备用。 所述溶液I的主要成分为蛋白酶K，溶液II的主要成分为氢氧化钠。 所述步骤（3)特异性条带PCR扩增优选循环参数如下： 94°C下预变性5min，循环1次； 94°C下变性30s，Tm下退火45s，72°C下延伸60s，循环35次； 72°C下延伸6min，循环1次； 16Γ下lOmin，循环 1 次。 所述步骤⑷专一性限制性内切酶HpyCH4V酶切优选步骤如下：将步骤⑶获得 的特异性条带PCR扩增得到的产物lug、lOUnit限制性内切酶HpyCH4V及2ul10X酶切缓 冲液及三蒸水组成20ul体系，37°C加热lh，即可完成酶切。 步骤（5)所述凝胶电泳优选琼脂糖凝胶电泳。 步骤（5)的结果显示如下：经电泳后，所述携带线粒体tRNATto 15909A>G突变样本 酶切产物为两条带，而不携带该突变样本的产物为一条带。 基于上述的检测线粒体tRNATto 15909A>G突变的方法制备的试剂盒，含有： (1)提取样本全基因组DNA所需的试剂，包括细胞裂解液、溶液I、酚-氯仿-异戊 醇混合液和溶液II; (2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、引物、Taq酶和三蒸水； (3)酶切反应试剂，包括：限制性内切酶HpyCH4V、酶切缓冲液。 上述检测线粒体tRNATto 15909A>G突变的方法或基于检测线粒体tRNAThl!5909A>G 突变的方法制备的试剂盒在检测线粒体tRNATto 15909A>G突变的应用。 用本专利技术的检测线粒体tRNATto 15909A>G突变的方法及其试剂盒具有以下特点： 1.相比目前已有的点突变检测方法，例如第一代基因测序技术、变性高效液相色 谱（DHPLC)和基因芯片等检测技术，本试剂盒借助特异性PCR技术与专一性限制性内切酶 HpyCH4V特异性的识别TGCA回文结构的特点，每份DNA样本用特异性引物进行PCR扩增，然 后用专一性限制性内切酶HpyCH4V进行1次酶切即可在几小时内对原发性高血压相关的线 粒体tRNAThf 15909A>G突变进行检测。2本专利技术提供的线粒体tRNAi15909A>G突变检测方法及试剂盒与其他检测方法 相比，成本低、精确、快速、操作简便、易掌握；对仪器设备及操作人员无特殊要求，适合在一 般医院、分子生物实验室开展，为全国性开展原发性高血压高危人群的大规模筛查和预防 性检查提供条件，做到早筛查、早预防和早治疗。【附图说明】 图1为本专利技术方法的原理图 图2为本专利技术一个实施例中特异性条带扩增循环条件。 图3为本专利技术一个实施例中突变样本、对照样本PCR产物及酶切产物电泳图。 图4为本专利技术一个实施例中突变样本、对照样本测序验证酶切方法图。 图3中泳道9为Maker;泳道7、8为正常样本酶切产物；泳道1、2、3、4、5、6分别为 突变样本酶切产物。 具体实施 实施例1 本实施例提供一种检测线粒体tRNAi15909A>G突变的方法，其原理如图1所示， 其具体步骤如下： 1.收集标本：从细胞、血液以及组织样本中快速提取全基因组DNA，针对采样方 式、样本来源以本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种检测线粒体tRNAThr 15909A>G突变的方法，其特征在于，其包括如下步骤：(1)提取全基因组DNA；(2)设计特异性引物：根据人类线粒体基因剑桥参考序列(Human Mitochondrial DNA Revised Cambridge Reference Sequence，GenBank登陆号：NC_012920.1)在15909位点前后345bp和183bp处设计上游引物15909F、下游引物15909R；(3)特异性条带PCR扩增；(4)专一性限制性内切酶HpyCH4V酶切：所述专一性限制性内切酶HpyCH4V特异性的识别TGCA回文结构，tRNAThr15909A>G突变后，产生限制性内切酶HpyCH4V识别的TGCA回文结构，快速酶切；(5)突变鉴定：将酶切后的产物进行凝胶电泳。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：管敏鑫，薛凌，唐霄雯，郑斌娇，林枝，
申请(专利权)人：温州迈拓生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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