本发明专利技术公开了一种从红冬孢酵母（Rhodosporidium kratochvilovae）YM25235中分离的编码苹果酸酶的核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，通过构建重组载体并在大肠杆菌BL21中高效表达，表达产物具有苹果酸酶功能。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种苹果酸酶(Malic enzyme)基因及其重组表达载体，具体涉及以红冬抱酵母(Rhodosporidium kratochvilovae) YM25235 cDNA为模板，扩增得到编码苹果酸酶(ME)的基因欣通5么将其连接至表达载体，进一步转化至大肠杆菌BL21中，诱导表达，镍柱亲和层析纯化重组蛋白，并对纯化后的蛋白进行了酶活测定。属于微生物基因工程和酶工程领域。
技术介绍
苹果酸酶(malic enzyme，ME)是调控苹果酸代谢的关键酶，可以催化苹果酸进行氧化脱羧为丙酮酸和C02，同时伴随着NAD(P)+的还原；苹果酸酶普遍存在于生物体内；根据辅酶因子的不同，苹果酸酶可分为两种:NAD_苹果酸酶(NAD-Malic enzyme ；NAD-ME ；EC 1.1.1.38 和 EC 1.1.1.39 )和 NADP-苹果酸酶(NADP-Malicenzyme ;NADP_ME ；EC1.1.1.40。本专利技术主要是针对NADP-苹果酸酶)基因进行研究。通常认为，NADP-ME为各种细胞组分的合成提供还原力NADPH。例如在产油微生物油脂合成代谢调控中，NADP-ME持续为脂肪酸合成酶进行链延伸提供NADPH (Song Y D,Wynn J P, et al, Microbi, 2001, 147 (6):1 507-1 515.)。NADP-苹果酸酶在植物的生长代谢及发育过程中也扮演着重要角色，植物中苹果酸酶的底物和产物参与多种代谢途径，包括光合作用和呼吸作用。如热带C4植物中的固碳作用，保持植物细胞的渗透势，稳定细胞质的PH和保持植物根系的离子吸收平衡起重要作用，是生物体生命活动中重要的酶之一(Drincovich M F，Casati P, Andreo C S, FEBS Letters, 2001,490:1-6.4 ；Martinoia E， Rentsch D， Annual Review of Plant Phys1logy and PlantMolecularB1logy, 1994，45: 447- 467.)。此外，植物NADP-ME被认为参与植物防御反应。另有报道表明，NADP-ME参与了果实的成熟，通过苹果酸代谢来平衡细胞内的pH，还通过代谢提供碳源和NADPH调节一些底物及辅助因子来参与脂肪酸的合成。NADP-ME也是景天酸代谢途径(CAM)植物的一种重要脱羧酶，酶活性昼高夜低；兼性CAM植物随着C3光合型向CAM型转化，其NADP-ME酶活性涿渐升高，干旱诱导CAM植物其NADP-ME酶活性比C3增加3倍，由此表明:NADP_ME在CAM植物的活性调节中起重要作用。在CAM运行和调节中，NADP-ME和PEP (磷酸烯醇式丙酮酸)羧化酶一样，具有重要调节作用(王晨，西北植物学报，1997，17 (2): 200-204.)。苹果酸酶作为生物体中枢代谢途径的关键酶，也可应用于厌氧混合酸的发酵工程及酿酒工业。因此本专利技术通过发掘高效、特异性新基因苹果酸酶MI3410ME1，与pET-32a(+)质粒进行重组，并实现在E.coli BL21中表达。为苹果酸酶应用于工业和农业奠定基础。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从红冬抱酵母(Rhodosporidium kra tochvilovae)YM25235中分离的苹果酸酶基因及该基因编码的氨基酸，该基因核苷酸序列如SEQID NO: 1所示，或与SEQ ID NO: 1互补的核苷酸序列，该基因序列长为1911bp (碱基)，其中1-1911为编码苹果酸酶成熟多肽的开放阅读框；该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本专利技术的另一目的是提供一种含有苹果酸酶基因欣重组表达载体pET32aRKME2，该重组表达载体是将SEQ ID NO: 1所示基因直接与载体pET32a ( + )所构建的重组表达载体。本专利技术另一目的是提供一种含有上述的苹果酸酶基因或上述的重组表达载体的宿主表达细胞，比如大肠杆菌BL21菌株。本专利技术提供的核苷酸序列SEQ ID NO: 1是一种高效、特异性的苹果酸酶基因，将其与表达载体连接后转化至宿主细胞内生产苹果酸酶，具有产物特异性高、生产周期短、生产不受季节、气候的影响，可以通过利用转化至不同的宿主细胞来开发商业化苹果酸酶等优点。本专利技术应用基因工程技术构建苹果酸酶重组表达载体pET32a RKME2，将其转化至大肠杆菌生产苹果酸酶，具有操作简单、成本低、可行性高等优点，为苹果酸酶基因工程化生产奠定基础。【附图说明】图1为本专利技术苹果酸酶基因构建的大肠杆菌重组表达质粒pET32a RKME2图谱；图2为本专利技术的苹果酸酶基因诱导表达并纯化后的SDS-PAGE分析图:其中:1为蛋白电泳Marker ;2为转化了 pET32a ( + )并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；3为转化了 pET32aRKME2并经过IPTG诱导的大肠杆菌BL21总蛋白；4为纯化的目的蛋白条带。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例对本专利技术作进一步详细说明，但本专利技术保护范围不局限于所述内容，实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。 实施例1:红冬孢酵母YM25235苹果酸酶基因的克隆米用 0MEGA 试剂盒 E.Z.N.A Fungal RNA Kit 从红冬抱酵 ^iRhoclosporidiim克ra1cAKiJoKae) YM25235 中提取总 RNA，用反转录试剂盒 Thermo Scientific Maxima ΗMinus First Strand cDNA Synthesis Kit 合成 cDNA，取 1 μ 1 cDNA 为模板进行聚合酶链式反应；设计引物(引物1和引物2)进行PCR扩增，反应所用引物、组分和扩增条件如下:引物 1:RKME2-F1:5'- ATGCCCGCCCCGACGACGCTCCTCGGCGCT-3' (SEQ ID N0:3)引物 2:RKME2-R1:5'_ TCAGACGTCAACGAGCTCGAGGGGGCGGTA-3' SEQ ID NO:4) PCR扩增体系(50 μ L)组成如下: 5XFast Pfu Buffer10 μ L dNTP (2.5 μπιοΙ/L)5 yL 模板 cDNA1 μ L RKME2F (10ymol/L)1 yL RKME2R (10ymol/L)1 yLFast Pfu DNA polymerase (5U/μ L) 1 μ L无菌ddH20补足至50 μ L ; 扩增条件:94°C变性4min，再用94°C 40s、58.0°C 40s、72°C 2min进行30个循环，最后72°C lOmin，反应完后取产物1 μ L，然后在浓度为1%的琼脂糖凝胶中，进行电泳分析。经凝胶成像系统成像确认片段大小正确后，用百泰克生物技术有限公司多动能DNA纯化回收试剂盒回收目的片段，然后将PCR扩增得到的目的基因连接到pMD18-T上，连接产物转当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种苹果酸酶基因RKME2，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张琦，王俊，季秀玲，魏云林，林连兵，
申请(专利权)人：昆明理工大学，
类型：发明
国别省市：云南;53
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