本发明专利技术公开了人干扰素IFN-γ与人抗菌肽LL-37的基因改造、融合表达与纯化。所获得的IFN-γ与LL-37融合蛋白同时具有IFN-γ的抗病毒活性和LL-37的抗菌活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
技术介绍
人Y干扰素属于II型干扰素，属于分泌型蛋白，分泌后去除信号肤后其分子由 143个氨基酸组成，相对分子量为40kDa，W同源二聚体或四聚体的形式存在。人Y干扰素 由人T细胞和NK细胞产生，其合成的相关基因位于人的12号染色体上。Y干扰素在临床 上常用于抗病毒和抗肿瘤。 Y干扰素可抑制多种病毒的繁殖，从而在病毒感染的治疗方面获得广泛的应用。 Y干扰素抗病毒活性具有种间选择性，在异种细胞或机体内，其抗病毒活性会显著降低。同 时，Y干扰素Y干扰素在体内能抑制肿瘤细胞生长，防治肿瘤的转移和复发。临床应用表明， Y干扰素对毛细胞白血病、黑色素瘤、皮肤瘤、慢性髓样白血病、神经胶质瘤、淋己瘤及骨髓 瘤等均具有良好疗效。y干扰素既可通过诱导肿瘤细胞调亡和干扰肿瘤细胞的生长周期等 方式直接杀死肿瘤细胞，也可通过抗肿瘤组织的血管生长从而抑制肿瘤细胞生长，还可通 过调节人体免疫系统增强人体自身对肿瘤细胞的清除能力。 人化-37全长37个氨基酸，分子内无二硫键，其N端丝氨酸被己献化，但缺少己 献化对其活性影响不大。由于基因工程菌的重组人化-37无法实现己献化，为此考虑将人 化-37置于融合蛋白的C端。因此如何设计一个适合连接肤是该分子设计的关键。若连接 肤太长，两个药物的协同作用可能减弱，若太短，可能影响到干扰素Y与受体的结合，只有 适宜的连接肤不仅将两个药物连接成一个大分子，而且不会影响到两个药物保持各自的功 能。该融合蛋白采用十几个氨基酸残基的连接肤，使得两个药物不仅较好地保持各自的功 能，而且具有协同效果。【
技术实现思路
】[000引 1.人α-37与IFN-YDNA序列的密码子优化 在保证人化-37与IFN-Υ氨基酸序列完整性的前提下，按照Ρ.pastoris对密码 子的偏好性特点，对他们的DM序列进行优化。 2重组人化-37和人干扰素Y基因的连接先用引物化sense(5 ' -GACTCGAGTTCGCCTTGTTGGGTGACTTCTTCA-3 ')和化a ntU5 ^-GCCAGAGCCACCTCCGCCTGAACCGCCTCCACCGGACTCGGTTCTTGGAACCAAGTTT-3 ^ ) 扩增α-37 基因，用引物IFNsens巧'-TCAGGCGGAGGTGGCTCTGGCGGTGGCGGATCG CAGGACCCGTACGTTAAAGAA-3 ')和IFNanti巧'-CGTCTAGACTACTGAGATCTTTTACGTTTAC C-3')扩增干扰素Y基因，并分别纯化。再W化-37和IFN-Y为模板，用引物化sense和 IFNanti进行重叠PCR，将IFN-Y与化-37基因连接在一起。 3重组人化-37和人干扰素Y融合蛋白表达载体构建 对IFN-γ与化-37基因连接产物进行甜aI、化οI双酶切，同时对载体pPICZaA 也进行甜al、化〇1双酶切，再用琼脂糖凝胶电提取，然后用T4DM连接酶将双酶切后的 载体pPICZaA和目的基因IFNY-α-37进行连接，W将IFNY-α-37插入到载体pPICZaA 中。然后转化感受态E.coliT0P10,涂布含25mg/100ml博来霉素的培养皿来筛选重组质粒 pPICZaA/IFNy-a-37。 4重组质粒转化毕赤酵母 用化〇1单酶切pPICZaA-FaU-IFN成线性重组质粒，通过电击转化法将其转入 P.pastorisGS115 中构建重组菌P.pastorisGS115LI。电击条件为 1500kV，200Q，25uF。 转化液涂布于MD平板3(TC静止培养3天，挑选阳性克隆，摇瓶后，用真菌基因组提取试剂盒 提取基因组进行PCR鉴定。引物为化sense和IFNanti，退火温度为55°C，WGS115基因组 及未加模板的体系为对照组。 5重组菌表型鉴定及多拷贝筛选 通过甲醇利用情况进行重组菌表型鉴定。将PCR鉴定的阳性转化子编号，并将每 菌株用灭菌牙签同时接种MD和MM平板，3(TC静止培养5天，观察各菌株在两种平板上的生 长情况。 通过遗传霉素（G418)浓度梯度筛选多拷贝重组株。首先制备遗传霉素质量浓度 为0. 25、0. 5、1. 0、2. 0、3.Omg/mL的YPD平板，然后将前面筛选的表型正常的重组菌株用灭 菌牙签点在5个遗传霉素梯度平板上，3(TC静止培养4天，观察结果，能在高浓度下生长良 好的菌株为多拷贝菌株。 6融合蛋白发酵与纯化 将筛选的重组菌株，接种于25血BMGY培养液中，30°C250巧m/min培养约16h，至 菌液ODe。。W5,4°C4000巧m/min离必5min，收集菌体，用25血BMMY培养液重悬细胞，诱 导培养，每2地按体积比为0.5%加入纯甲醇，连续诱导14地^上，41：12000巧111/111111离必 5min，收集上清于-2(TC冻存待用。 上清液中的融合蛋白先用85%饱和度（NH4)2S04盐析，4°C静止20~24小时， 12000巧m/min离必15分钟收集盐析沉淀并溶于适量去离子水，用抑7. 2、10mmol/L磯酸缓 冲液透析除硫酸倭。透析结束后离必除不溶物得到粗融合蛋白溶液。将融合蛋白粗液先在 起始缓冲液中平衡，然后上CM32阳离子交换纤维素柱，从0.Imol/L至0.3mol/LAAB梯度洗 脱，收集含IFN-Y-α-37融合蛋白的洗脱成分。将上柱收集液用抑7. 5、25mmol/L磯酸缓 冲液平衡后上DEAE-52阴离子交换纤维素柱，从含0.Imol/L至0. 3mol/L的化C1的化7. 5、 25mmol/L磯酸缓冲液梯度洗脱，收集含IFN-Y-α-37融合蛋白的洗脱成分。再将上述收集 液经冷冻干燥浓缩至1半体积，上Se地adexG-100凝胶层板柱，用抑7. 5、25mmol/L磯酸缓 冲液洗脱，收集含IFN-Y-α-37融合蛋白的洗脱成分。 7IFN-Υ与α-37融合蛋白的检测 7. 1融合蛋白纯度检测[002引用SDS-PAGE法检测融合蛋白纯度，检测参照文献进行。WTakara蛋白分子质量 标准（低）为Marker。W未经诱导的发酵液为空白对照。 7. 2融合蛋白浓度检测W牛血清白蛋白为标准，按Low巧法测定融合蛋白浓度。 7. 3融合蛋白产物活性分析 培养液中IFN-Y的活性分析参照《中国药典2010版》中《干扰素效价测定（细胞 病变抑制法）》。活性标准品购自广州市药品检测所。W总IFN-Y活性计算纯化过程中的 回收率。 培养液中化-37的活性测定参照文献17。用大肠杆菌ATCC25922W及ML35p作 为检测菌种，用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径3mm的圆孔，每孔加10μL发 酵液，当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人干扰素IFN‑γ与LL‑37的融合蛋白，其是：a)具有与SEQ ID No.1的1‑195位氨酸序列所示的肽链，或b)在SEQ ID No.1基础上通过缺失、突变、重组获得的具有人干扰素IFN‑γ与LL‑37活性的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万徐萍，
申请(专利权)人：广东紫金正天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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