应用于高通量测序的核酸分子定量方法技术

本发明专利技术旨在通过改进高通量测序中样本文库制备过程及对应的数据分析方法实现对特异核酸分子在样本内或样本间的相对与绝对定量。将具有一系列已知浓度的不同序列的核酸分子混合物（标准品）加入固定量的样本或者抽提后的核酸样本中，均匀混合后进行建库测序并生物信息学分析。分析过程中依据不同标准品分子的浓度与读取的次数（reads，或矫正后的reads）的关系确定浓度-读取次数数理模型，然后利用该数理模型将感兴趣的核酸分子reads数转换为浓度从而得到绝对或相对定量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分子生物学，涉及核酸序列测序与分子定量，尤其是利用高通量测序 方法对DNA与RNA直接定量。
技术介绍
[000引相对于sanger测序方法，高通量测序可从陕速高效的确定样本中所含DNA与RNA序列信息，并W特异序列和读取频率为基础分析包含染色体变异、基因突变、RNA表达与剪 切W及甲基化在内的分子水平事件，从而对生物研究W及临床诊断提供可靠的检测方法。目前高通量测序在临床上的应用方兴未艾。对癌症患者血液循环肿瘤DNA(ctDNA) 测序获取体突变位点及ctDNA的含量用于伴随诊断指导用药与复发检测，也可W用于健康 人群全身的防癌体检。对器官移植患者的血液游离DNA高通量测序可W有效的区分 自体与供体的单核巧酸多态（SNP)的碱基差异，通过检测移植器官DNA在受体患者血液中 的含量变化可W有效的检测移植排斥反应。利用数W万计的16S序列信息鉴定环境 微生物种群及相对丰度极大的加深了我们对肠道微生物的理解，并将微生物生态与人体健 康关联起来。虽然高通量测序广泛的应用于W上研究领域，包括确 定序列信息与序列间的相对丰度，但目前还没有有效的方法利用高通量测序直接对原始样 本中每条特异核酸绝对定量，必须额外依靠实时英光PCR定量法（qRT-PCR) 或者数字 PCR法(digitalPCR)。本专利技术对现有的高通量测序方法进行改进，在样本处理过程中 加入一系列已知浓度的标准核酸序列标准品，通过后期信息分析构建出标准浓度曲线从而 可W对样本所有的序列进行绝对定量。
技术实现思路
本专利技术提供一种标准品，该标准品是由若干种已知浓度的不同序列的核酸分子组 成，该标准品与待测样本混合后可W用于高通量测序的样本制备。特别强调的是该核酸标 准品的分子序列可W用信息学分析与待测样本的中的核酸序列区别。 标准品的设计与采用不同的测序方法相关，目的是使标准品与待测核酸分子无偏 差的共同进行下一步的建库测序与分析。利用PCR捕获测序方法时，例如16S的PCR建库 测序，标准品中的核酸分子应该在分子两端具有PCR所需引物互补序列。实施方式之一，将 16S的PCR引物515F与806R之间插入一段GAPDH序列，并且在GAPDH与引物之间插入经过 编码的4位碱基来区分不同浓度的分子，该实施例中的标准品中核酸分子的具体序列与对 应浓度见表1。对于使用核酸探针捕获测序，需要将核酸标准品的序列作为捕获区域的一部 分进行探针设计。实施方式之一，标准品中的核酸分子是每隔20bp进行碱基转换编码的人 源GAPDH序列，不同浓度的标准品分子碱基转换的分子位置不同，W便正常人源GAPDH及不 同标准品核酸分子相互区分，该实施例中的标准品中核酸分子的具体序列与对应浓度见表 3。在使用DNA随机打断建库方法时，标准品种的核酸分子应该与打断后DNA具有相当的碱 基数量，例如最终打断DM片度为180-250,则标准品分子的长度也应该在送个范围内。测 定基因表达谱实验中利用polyT与具有polyA尾己的mRNA互补结合方法中，标准品中不同 浓度的核酸分子也应该具有与待测样本一样的polyA尾己。W上不同应用的实验与分子序 列设计方法都是本领域有经验的技术人员W"使标准品与待测核酸分子无偏差的共同进行 下一步的建库测序与分析"为目的时所熟悉的。 本专利技术还提供一种样本处理与建库方法，该方法W标准品与待测样本W-定比例 混合物为原始样本进行测序前样本处理与建库。该比例根据待测样本的浓度W及标准品 的浓度可W适当调节，W达到标准品最优的浓度覆盖范围和测序数据量大小。所述的建库 方法，比如直接打断建库，PCR富集目标片段建库与探针杂交捕获方法是本领域技术人员所 熟悉，具体方法包括单不局限于实施方式之一中使用IlluminaTruSeq建库试剂盒建库， AgilentSureSelect探针进行目标区域捕获。 本专利技术还提供一种信息分析方法原理，利用标准品中不同的已知浓度的分子在样 本数据中对应的reads数拟合数理模型。最后根据感兴趣的分子序列reads数代入该数理 模型，从而得到同一样本中感兴趣分子的最终浓度，也可W比较不同样本间相同或不同序 列的相对浓度。其中，拟合数理模型中使用的reads数可W是数据质控后直接得到Reads 数，例如实施方式之一中的16SPCR产物中标准品的Reads数，也可W是校正后的reads数， 例如实施方式之一中根据捕获外显子大小校正后的单位长度的Reads数。拟合数理模型采 用的方法是本领域有经验的技术人员所熟悉的方法，包括但不限于线性回归方程。 本专利技术还提供一种直接利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的 方法，包括标准品的制备，样本处理和文库制备方法，高通量核酸测序分子的方法W及对应 的信息分析处理方法。 实施方式之一中，检测肠道提取物中厚壁菌口 16S的含量： (1) 从人体粪便中提取固定体积的DNA样本，作为待测样本； (2) 将待测样本与标准品W9:1比例混合，该混合物作为模板利用16S特异引物进 行PCR扩增； (3) 将扩增产物建库并使用MiSeq测序； (4) 利用生物信息学工具构建标准品浓度与Reads数（Tags)数理模型； (5) 将厚壁菌口 16S所包含的化gs数量代入模型得出待测样本中的绝对浓度。 在另一实施方式中，检测结直肠癌患者血浆游离DNA中含有V600EctDNA的浓度： (1) 将患者血浆与标准品99:1进行混合后提取血浆总游离DNA(C巧NA); (2) 提取的cfDNA建库后使用探针捕获感兴趣的DNA区域，包括肿瘤相关的的BRAF 外显子与标准品对应的GAPDH同源分子； (3) 使用高通量测序仪对捕获文库测序； (4) 利用生物信息学工具构建标准品浓度与Reads数数理模型； (5) 将含有BRAFV600E突变的Reads数量代入模型得出待测样本中的绝对浓度。 本专利技术还提供一种直接利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的 系统，包括：定制好的标准品，建库所需的试剂，测序与分析所需的仪器W及生物信息学分 析需要的软件系统。可W将所述系统包装为试剂盒的形式，其中包括装有上述组分的容器 和关于使用该试剂盒对感兴趣核酸分子进行相对和绝对定量的说明。 本专利技术提供的直接利用高通量测序对特定核酸分子进行相对与绝对定量的方法， 集成了高通量测序的高分辨率与传统定量方法准确的双重优点。Real Time PCR定量与 digital PCR定量方法可W准确的对特定序列和低频突变进行准确定量，但缺点是只能针 对已知的特定位点进行检测，不能用于对未知或者不确定的序列或突变分子定量，而且检 测通量很小，一次机器运行最多只能检测几十种分子指标。高通量测序可W高通量的对所 有感兴趣的核酸序列进行无偏差分析，预先不需要知道样本中的序列信息，所W可W发现 未知的序列或突变。但由于实验方法所限，高通量测序只能得到同一个文库中序列的相对 浓度，无法比较不同样本间的相对浓度，更不能对某条序列进行绝对定量。本方法通过引入 可W在不同样本间横向比较的标准品实现了样本间的相对定量，而且利用标准品中具有已 知浓度的不同分子的reads数构建数理模型实现了对测序结果中所有序列的绝对定量。 本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种可以用于正常建库的核酸标准品。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：焦少灼，
申请(专利权)人：焦少灼，
类型：发明
国别省市：北京;11