一种纳米羟基磷灰石基因载体及其制备方法技术

本发明专利技术公开了一种纳米羟基磷灰石基因载体及其制备方法。该基因载体包括作为载体本体的纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物。本发明专利技术通过改良载体的制备工艺制造出毒性较低、且体外转染率大于50％的HAP基因转染载体。本发明专利技术用PEI-PEG对HAP纳米颗粒进行有效的功能化修饰，可使修饰后的非病毒载体的体外转染率大幅度提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于复合材料
，尤其设及一种纳米径基憐灰石基因载体及其制备 方法。
技术介绍
基因治疗是现代临床治疗学创新性的进展之一，其作用越来越重要。从理论上说， 它将在很大程度上改变人类治疗疾病的传统方式，为治疗甚至治愈各种难治性疾病提供有 效的方法。从目前对基因治疗的研究进展来看，基因治疗技术的四大要素（治疗基因、祀细 胞、基因载体和基因转染途径）中，限制其向临床应用推广的重要瓶颈之一是缺乏理想的 有选择性的、高效率且低毒的基因转染载体W协助目的基因进入祀组织中的祀细胞。基因 载体的研究自然成为基因治疗研究中的热点。 基因载体可分为病毒载体和非病毒载体两大类。病毒载体最大的优点是其在体 内外的转染率很高，但制备复杂，祀向性差，可W引起宿主免疫反应W及基因突变致癌，严 重的甚至导致死亡。虽然近年研发的病毒载体的毒副作用已有明显减轻，但上述两大隐 患与病毒载体的异种蛋白质属性和对宿主基因组的插入方式有关，短期内仍无法彻底解 决，运在很大程度上限制了其临床应用。目前常用于基因转染的非病毒载体主要有脂质体 (liposome)、纳米载体（nanovector)和阳离子聚合物kationicpolymer)，在纳米尺寸范 围的脂质体和阳离子聚合物有时也被称为纳米载体。 ①脂质体，是由可生物降解的憐脂组成的双分子层结构，与生物膜有较 大的相似性和组织相容性，是目前最常用的非病毒载体，其代表有Lipofectin和 Lipofectamine2000。脂质体在体内不够稳定且有一定毒性；体外转染率在非病毒载体中是 较高的，但仍只有病毒载体的60%~70%左右，体内转染率更低。国内、外均有用阳离子脂 质体向动物耳蜗转染目的基因的报道。 阳0化]②阳离子聚合物，其表面有大量的分子基团，便于携带DNA分子。可分为人工合 成和天然材料2大类：人工材料的代表是聚乙締亚胺（PEI)和聚酷胺-胺型树枝状高聚物 (polyamidoamineden化imer,PAMAM-D);天然材料有壳聚糖、胶原、藻酸盐等。阳离子聚合 物也存在转染率低和轻度的细胞毒性问题。PEG作为水溶性高分子，不仅能改善其他高分子 的水溶性，而且常用作纳米颗粒表面改性修饰剂，来改善其性能。 阳006] ③纳米载体，一般是指载体粒径在纳米量级（Inm~lOOnm)范围内的非病毒载体。 随着纳米颗粒尺寸变小，其表面原子占原子总数的比例会增高，即比表面积增大，粒子表面 能也随之迅速增加，具有很高的化学活性，其理化性质也会与其本体产生很大的差别。经化 学修饰的表面带正电荷的纳米颗粒可通过静电结合方式吸附表面带负电荷的基因DNA，并 将其易被核酸酶攻击的位点封闭起来，达到携带、运送和保护DNA的目的。纳米颗粒制备和 胆存方便、装载量大，能穿过组织间隙并被细胞吸收，可通过人体最小的毛细血管和血脑屏 障，且无免疫原性和致瘤性，低毒或无毒。运些特性使其在药物和基因输送方面具有许多优 越性。根据纳米载体的性质，可将其分为无机纳米载体和有机纳米载体两大类。无机载体 如纳米径基憐灰石（HAP)、金银单晶纳米、娃氧化物、铁氧化物和碳纳米管颗粒等，属狭义的 纳米载体范畴；有机载体如脂质体、阳离子聚合物等，只要粒径在纳米尺度范围，也可叫做 纳米载体。HAP是人体骨质和牙齿的主要成分（Caie(P〇4)e(〇H)2)，无毒、生物相容性好，已广泛 用作人体各类植入材料。Zhu等WHAP作为基因载体将携带绿色巧光蛋白基因的质粒转染 进肿瘤细胞。为寻找毒性更低、且具有达到使用要求的转染效率的基因载体，孙虹教授领 导课题组进行了连续多年的实验研究，于2005年成功地应用HAP纳米载体将神经营养素 3(NT-3)基因转染到活体豚鼠的耳蜗神经元内和体外培养的小鼠耳蜗螺旋神经节细胞中， 并表达出基因产物NT-3,且其毒性小于脂质体。然而，虽然经过多次改良，其体外转染效率 一直徘徊在15%~30%运种较低的水平，难W满足实际应用的需要。
技术实现思路
本专利技术旨在克服现有技术上述的不足，提供一种纳米径基憐灰石基因载体及其制 备方法 为了达到上述目的，本专利技术提供的技术方案为： 所述纳米径基憐灰石基因载体包括作为载体本体的纳米径基憐灰石，所述纳米径 基憐灰石表面被聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰。 W11] 其中，所述基因载体长度为50-80皿，直径为20-30皿，电荷在25-40mv。 上述纳米径基憐灰石基因载体的方法是用聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚 物修饰纳米径基憐灰石：将聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶于极性溶剂（所述极 性溶剂是可W溶解聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物的溶剂，如去离子水），配成聚乙 締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物浓度为50-150mg/mL的聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇 共聚物溶液；将纳米径基憐灰石粉末溶于极性溶剂（所述极性溶剂是可W溶解纳米径基憐 灰石粉末的溶剂，如去离子水），配成纳米径基憐灰石浓度为1-lOmg/mL的纳米径基憐灰石 溶液；将聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物溶液加入纳米径基憐灰石溶液中，得到聚 乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物质量浓度为2-8%的聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇 共聚物纳米径基憐灰石混合溶液；将混合溶液振荡并超声分散后得到的悬浮体离屯、，将离 屯、得到的沉淀再进行超声处理，得到纳米径基憐灰石表面被聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二 醇共聚物修饰的纳米径基憐灰石基因载体。 其中，制备聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物方法如下： 先制备单甲氧基聚乙二醇幾基咪挫，然后通过单甲氧基聚乙二醇幾基咪挫合成聚 乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物。 单甲氧基聚乙二醇幾基咪挫的合成路径如下： 具体是将单甲氧基聚乙二醇放入冷冻干燥机干燥过夜，往单甲氧基聚乙二醇 中加入干燥的四氨巧喃溶解，得到溶液1，甲氧基聚乙二醇与四氨巧喃的重量体积比为g/ml;在避光下往N，Ν'-幾基二咪挫（CDI)中加入四氨巧喃溶解，得到溶液2，N，N'-幾基二咪挫与四氨巧喃的重量体积比是g/ml，在氮气保护下将溶液1 加入到溶液2中，然后在氮气保护下，于55-65Γ揽拌过夜，产物旋干液体后溶于去离子水， 用二氯甲烧萃取后冷冻干燥即得单甲氧基聚乙二醇幾基咪挫。 通过单甲氧基聚乙二醇幾基咪挫合成聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物的 路径如下： 具体是是将单甲氧基聚乙二醇幾基咪挫溶于干燥后的Ξ氯甲烧中，得到溶液3,单 甲氧基聚乙二醇幾基咪挫与Ξ氯甲烧的重量体积比为g/ml;将聚乙締 亚胺溶解于Ξ氯甲烧中，得到溶液4,聚乙締亚胺与Ξ氯甲烧的重量体积比为g/ml;将溶液3滴加到溶液4中，回流磁力揽拌过夜，产物旋去部分Ξ氯甲烧液体（通 常20ml液体旋去15ml左右Ξ氯甲烧），加入到冰乙酸中，得白色粘稠沉淀，离屯、，沉淀溶 于二氯甲烧，再用乙酸沉淀，产物溶于去离子水，用透析袋将溶有产物的去离子水中透析 45-50h，间断更换去离子水，冷冻干燥后得聚乙締亚胺-单甲氧基聚乙二醇共聚物。 另外，所述的纳米径基憐灰石的制备方法如下： 称取每4. 428gCa(N03)2· 4&0粉末对应溶于125ml去离子水中，揽拌均匀制成浓 度为0. 15mmol/L的溶液； 称取每1.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种纳米羟基磷灰石基因载体，其特征在于，所述基因载体包括作为载体本体的纳米羟基磷灰石，所述纳米羟基磷灰石表面被聚乙烯亚胺‑单甲氧基聚乙二醇共聚物修饰。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：孙虹，王风君，吴学文，强清芬，徐震航，刘明宇，
申请(专利权)人：中南大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43