一种真菌基因敲除的方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种真菌基因敲除的方法。该真菌基因敲除的方法包括：将Vika重组酶识别的核苷酸序列分别导入所述真菌基因组中目标基因的上游、下游；具有Vika重组酶活性的蛋白质识别、剪切Vika重组酶识别的核苷酸序列，敲除目标基因，获得敲除目标基因的真菌。本发明专利技术提供的真菌基因敲除的方法成功地将Vika-vox重组酶系统应用于真菌基因敲除，实现了目标基因的敲除，为真菌基因敲除提供了新的方法，更有利于对真菌基因的功能的研究、性能的优化。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因工程
，特别涉及。
技术介绍
基因敲除是一种基因修饰技术，针对某个感兴趣的遗传基因，通过改造令特定的 基因功能丧失，并研究其可能对相关生命现象造成的影响，进而推测该基因的生物学功能。 通过基因敲除，既可W实现用正常基因敲除突变基因W进行性状的改良和遗传病的治疗， 也可W用突变的基因敲除正常基因，W研究基因在发育和调控方面的作用。真菌的基因敲 除的应用主要包括；研究基因的结构与功能、改良工业生产菌株、W及次生代谢产物合成途 径的改造。目前，用于基因敲除的方法主要有W下方法；（1)利用基因同源重组进行基因敲 除；（2)利用随机插入突变进行基因敲除；（3)RNAi引起的基因敲除。其中，同源重组是多 种生物体内普遍存在的一种生理现象，它是生物体用于纠正自身值NA复制过程中产生）或 因外界因素诱导所致DNA突变的一种内在机制，其在基因敲除中应用最为广泛。利用随机 插入突变进行基因敲除的原理是利用某些能随机插入基因序列的病毒、细菌或其他基因载 体，在目标细胞基因组中进行随机插入突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后通 过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞，送种基因敲除方法工作量大，限定了其 应用。研究发现，少量的双链RNA就能够阻断基因的表达，并且送种效应也可W传递到子代 细胞中，所WRNAi的反应过程也可W用于基因敲除，RNAi干扰技术常用于真核生物的基因 功能的研究和基因敲除。 在真菌的基因组敲除中，常用的基因敲除的方法为利用基因同源重组进行基因敲 除。诱导性基因敲除是利用基因同源重组进行基因敲除的众多方法中的一种，其中，位点特 异性DNA重组酶（site-specificDNArecombinases,SSRs)是该基因敲除方法的重要工具 之一。位点特异性重组酶作用于特定的位点之间，由重组酶催化DNA骨架切割和重新连接， 由核必氨基酸介导双链交换。目前，被用于真菌基因敲除的位点特异性DNA重组酶主要为 化e重组酶，位点特异性DNA重组酶种类太少，限制了其应用，所W还需要新的适用于真菌 基因敲除的位点特异性DNA重组酶。2013年，Madina等人在Vibriocoralliil}ft;ixus弧 菌的瞻菌体中发现了一种新型的位点特异性重组酶Vika及其识别位点vox序列。
技术实现思路
本专利技术的专利技术目的在于提供。本专利技术提供的一种真菌基 因敲除的方法将Vika-vox重组酶系统应用于真菌基因敲除，实现了目标基因的敲除，为真 菌基因敲除提供了新的方法，更有利于对真菌基因的功能的研究、性能的优化。为了实现本专利技术的专利技术目的，本专利技术采用如下的技术方案： 本专利技术提供了，包括W下步骤： 步骤1 ;将Vika重组酶识别的核巧酸序列分别导入所述真菌基因组中目标基因的 上游、下游； 步骤2 ;具有Vika重组酶活性的蛋白质识别、剪切所述核巧酸序列，敲除所述目标 基因，获得敲除目标基因的真菌。 优选地，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，步骤1中的核巧酸序列为vox序 列，其具有SEQIDNO: 1所示的核巧酸序列。 优选地，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，步骤2中的具有Vika重组酶活性 的蛋白质具体为Vika重组酶，其具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列。 优选地，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，所针对的真菌为酵母菌。更为优选 地，本专利技术提供的方法中所针对的酵母菌为酿酒酵母。在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提 供的方法中所针对的酿酒酵母为BY4741或synlll。本专利技术提供的制备方法可W应用于酿 酒酵母，但不局限于酿酒酵母，更不局限于酿酒酵母BY4741或synlll，本领域技术人员可 W根据实际情况实施和应用本专利技术提供的方法。 本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，步骤2中的具有Vika重组酶活性的蛋白质 的来源，即可W是真菌基因组中的编码Vika重组酶的基因表达而得；也可W是真菌基因组 外的其他具有转录、翻译功能的DNA分子中的编码Vika重组酶的基因表达而得，例如，质 粒。 本专利技术中的编码Vika重组酶的基因是指该基因表达产物具有Vika重组酶的活 性，其能够识别、剪切Vika重组酶识别的核巧酸序列。本专利技术所述的导入为将外源DNA分 子整合到真菌的基因组中。 在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，步骤1还包括 将编码Vika重组酶的基因导入到真菌基因组中；Vika重组酶识别的核巧酸序列的导入、编 码Vika重组酶的基因导入的前后顺序不固定，也可W同时导入。 在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，编码Vika 重组酶的基因W基因表达模块的形式导入到真菌基因组中。 在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，编码Vika 重组酶的基因的基因表达模块由启动子、编码Vika重组酶的基因和终止子组成。 在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，编码Vika 重组酶的基因具有SEQIDN0:3所示的核巧酸序列。 优选地，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，编码Vika重组酶的基因的基因表 达模块中的启动子为诱导型启动子。在本专利技术的一些实施例中，该诱导性启动子可W为 GAL1。本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，编码Vika重组酶的基因的基因表达模块中的 终止子可W根据实际情况进行调整，可W为PGK1终止子、EN02t终止子或CYClt终止子。在 本专利技术的一些实施例中，该终止子具体为CYC1终止子。 在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法包括W下步骤： 步骤1 ;将Vika重组酶识别的核巧酸序列分别导入真菌基因组中目标基因的上 游、下游；将编码Vika重组酶的基因的基因表达模块导入真菌基因组中； 步骤2 ;诱导具有Vika重组酶活性的蛋白质的表达，具有Vika重组酶活性的蛋白 质识别、剪切Vika重组酶识别的核巧酸序列，敲除目标基因。 在本专利技术的另外一些实施例中，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，步骤1中 编码Vika重组酶的基因的基因表达模块导入真菌基因组中的整合位点位于目标基因的上 游或下游，且该整合位点位于整合到真菌基因组的Vika重组酶识别的核巧酸序列所在序 列片段的内部，但不破坏Vika重组酶识别的核巧酸序列。实验结果证实，按照此方法获得 的重组菌株在经过诱导之后，先表达具有Vika重组酶活性的蛋白质，之后具有Vika重组酶 活性的蛋白质识别、剪切Vika重组酶识别的核巧酸序列，即实现了目标基因的敲除，又实 现了编码Vika重组酶的基因的敲除，所W省略了去除外源编码Vika重组酶的基因的工作， 节省了大量的工作。 在本专利技术的一些实施例中，本专利技术提供的真菌基因敲除的方法中，真菌基因组中 含有化e重组酶识别的核巧酸序列、编码化e重组酶的基因时，步骤1中的目标基因为编码 化e重组酶的基因。本专利技术中的编码化e重组酶的基因是指该基因表达产物具有化e重组酶的活性， 其能够识别、剪切化e重组酶识别的核巧酸序列。 2011年，约翰.霍普金斯大学的Jef.Boeke教授在化化re上发表的人工合成酵 母基因组计划（Sc2. 0计划），通过重新设计并重头合成酿酒酵母基因组，减少基因组上 不稳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种真菌基因敲除的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤1：将Vika重组酶识别的核苷酸序列分别导入所述真菌基因组中目标基因的上游、下游；步骤2：具有Vika重组酶活性的蛋白质识别、剪切所述核苷酸序列，敲除所述目标基因，获得敲除所述目标基因的真菌。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：元英进，林秋卉，吴毅，姜国珍，李柄志，
申请(专利权)人：天津大学，
类型：发明
国别省市：天津;12