本发明专利技术公开了一种沙门氏菌核酸的恒温扩增检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包含DNA提取试剂、恒温扩增反应液、阳性对照和阴性对照；本发明专利技术的检测试剂盒特异性高、灵敏度高；核酸扩增反应全部恒定同一温度，恒温扩增仅需35分钟，核酸试纸条检测结果需1-2分钟，全程从接受样品到获得结果整个检测过程仅需1小时左右，且整个反应过程只需一个恒温仪器，特别适合食品中等沙门氏菌的现场快速检测与排除。
【技术实现步骤摘要】
【专利说明】-种沙口氏菌的核酸恒溫扩増检测试剂盒及检测方法 (-)
本专利技术设及一种针对沙口氏菌核酸的恒溫扩增快速检测技术，适合对沙口氏菌的 定性检测。 (二）
技术介绍
沙口氏菌广泛存在于自然界，至今已经发现的血清型就有2500种W上，我国已发 现216个。与人类疾病有关的血清型主要集中于A~E群，包括：伤寒沙口氏菌、甲、乙、丙型 副伤寒沙口氏菌、鼠伤寒沙口氏菌、猪霍乱沙口氏菌、肠炎沙口氏菌、鸭沙口氏菌、新港沙口 氏菌等，其中W鼠伤寒沙口氏菌、肠炎沙口氏菌及猪霍乱沙口氏菌最为常见。沙口氏菌引起 的食物中毒在日本、欧美占首位，亦是我国细菌性食物中毒的常见菌。在我国内陆地区，有 70%~80%细菌性食物中毒是由沙口氏菌引起的，是对人类和动物健康有极大危害的一类 食源性病原菌。 沙口氏菌的传统检测多采用细菌培养、生化和血清学鉴定等方法，此类方法操作 繁琐、费时费力、所需试剂繁多，经济成本高。随着免疫学和分子生物学的发展，现在已建立 了W抗原为主的免疫学检测方法如化ISA法，W及WPCR为基础的检测技术。ELISA操作 较为繁琐，费时较长；PCR检测方法快捷，灵敏，准确度较高，但是需要一定的设备和技术要 求，且试剂费用较贵，难W推广普及。为了实现基层能广泛进行肠炎沙口氏菌的快速检测， 有效防控该类细菌引起的食物中毒，建立实用、简便、快速、准确的肠炎沙口氏菌检测方法 十分必要。 近年来，LAMP方法受到关注，该方法W特定核酸为目标在等溫条件下通过有链置 换酶活性的DNA聚合酶作用而扩增，具有特异性高、灵敏性强，而且简便快速成本低廉的特 点。已在微生物检测等诸多领域广泛应用。本专利技术技术研制了恒溫扩增沙口氏菌核酸，并 结合核酸试纸条显色来判定结果的检测方法，且整个反应过程不打开反应管盖子，试纸条 流动检测过程密闭，杜绝了核酸扩增产物污染外界的可能性。研究表明该沙口氏菌恒溫扩 增-核酸试纸条检测方法具有特异性强、敏感度高、对仪器要求简单、检测时间短等优点， 所W非常适用在基层检验机构使用，同时在突发公共卫生事件的现场检测与临床上的床边 诊断上也具有很好的应用前景。 (Ξ)
技术实现思路
阳〇化]本专利技术目的是提供一种准确、灵敏、快速地检测沙口氏菌核酸的恒溫扩增检测试 剂盒及其检测方法。 本专利技术采用的技术方案是： 本专利技术提供一种沙口氏菌的核酸恒溫扩增检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组 成： (l)DNA提取试剂（优选Takara公司的BacterialGenomicDNAExtraction Kit(货号DV810A); (2)恒溫扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条交叉扩 增引物、lX化ermolbuffer、M拆04、dNTPs溶液、BstDNA聚合酶和无菌双蒸水；其中： 所述的外围引物分别为： 所述正向外围引物为：5' -AACAGTGCTCGTTTACGACC-3'(沈QIDNO. 2); 阳01引 反向外围引物为：5' -CTGATCGATAATGCCAGACG-3'(沈QIDNO. 3); 所述两条探针的序列分别为： 正向 5'端Biotin标记探针：5' -Biotin-AGGTAGGTAATGGAATGACGA-3'(沈QID NO. 4)；反向 5'端Fite标记探针 5' -Fitc-CGTTCTACATTGACAGAATCCTCAG-3'(SEQID NO. 5)； 所述两条扩增交叉引物分别为： 扩增正向引物： 阳0化]5 ' -GCGATCAGGAAATCAACCAGATAGAATGGTGATGATCATTTCTATGTTC-3 '(沈QID NO.6)； 扩增反向引物： 5f-CGTACTGGCGATATTGGTGTTTATATTMCAGTACCGCAGGAAAC-3f(沈QIDNO. 7); 阳02U做阳性对照冶有沙口氏菌invA基因片段的DM质粒； 阳0巧 （4)阴性对照巧菌双蒸水。 进一步，本专利技术所述的1XThermolbuffer组成为：20mM的Tris-肥1、lOmM的 KCl、10mM的（NH4)2S〇4、2mM的Μ拆〇4^及质量浓度为 0. 1% 的TritonX-100，pH7. 5。 进一步，本专利技术所述阳性对照为含有长238bp的沙口氏菌invA基因序列的片段， 所述片段的核巧酸序列如下（SEQIDNO. 1): 阳0巧]AACAGTGCTCGTTTACGACCTGAATTACTGATTCTGGTACTAATGGTGATGATCATTTCTATGTTCGTC ATTCCATTACCTACCTATCTGGTTGATTTCCTGATCGCACTGAATATCGTACTGGCGATATTGGTGTTTATGGGGTC GTTCTACATTGACAGAATCCTCAGTTTTTCAACGTTTCCTGCGGTACTGTTAATTACCACGCTCTTTCGTCTGGCAT TATCGATCAGTACCA 进一步，本专利技术所述阳性对照按如下步骤制备：W包含扩增区域的沙口氏菌invA基因片段为模板，通过两条外围引物进行PCR扩 增获得目的基因；利用PCR纯化试剂盒（Promega)对PCR扩增产物进行纯化；将纯化后的扩 增产物通过T-easy质粒转染试剂盒（Promega)构建完整的含有目的基因的质粒序列，用分 光光度计对所抽提的质粒测A2S。定量并10倍稀释，-2(TC保存。 进一步，本专利技术所述恒溫扩增反应液组成为：两条外围引物各自1化mol,两条探 针各自 20pmol，两条交叉引物各自 40pmol，lXThe;rmolbuffer,Μ拆〇4为6mmol，dNTPs溶 液各0. 4mmol，BstDM聚合酶8U，无菌双蒸水组成补足至25μ1。 本专利技术还提供一种所述沙口氏菌的恒溫扩增检测试剂盒的检测方法，所述检测方 法为： W30]a)用DNA提取试剂从待检测的标本中提取DNA;b)将步骤a)提取得到的DNA作为模板加入到装有恒溫扩增反应液的PCR管中，在 65°C下扩增反应35分钟；标准阳性模板（即阳性对照）加入阳性对照PCR管中，标准阴性 模板（即阴性对照）加入阴性对照PCR管中，所述标准阳性模板为含有沙口氏菌invA基因 片段的质粒，所述标准阴性模板为无菌双蒸水；C)将反应后的PCR管放置到核酸试纸条防污染检测装置（杭州优思达生物技术公 司3号装置）中进行检测，2分钟W后判读结果，当试纸条的检测线呈阳性时，说明样品中含 有沙口氏菌核酸。该试纸条包括在带有不干胶的衬垫上按顺序设有样品垫、有色颗粒结合 物垫和吸水滤纸垫，上述各部分在相邻处部分重叠，纤维膜上设有检测线和质控线，其中有 色颗粒结合物垫上的有色颗粒有抗Fite抗体包被，检测线上有亲和素包被，质控线上有抗 Fite抗体，有色颗粒选自胶体金颗粒、乳胶颗粒。 在本专利技术提供的试剂盒中，有两条外围引物，两条交叉引物和两条检测探针。本试 剂盒中的6条寡聚核巧酸序列依靠BstDNA聚合酶的高活性的链置换特性，使得链置换DNA 合成不断的自我扩增循环。在本专利技术提供的沙口氏菌核酸的恒溫扩增检测试剂盒中，对不 同的反应条件进行了优化，如引物和探针的浓度，Mg2+浓度，反应溫度等的优化，并将本专利技术 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种沙门氏菌核酸恒温扩增检测试剂盒，其特征在于所述试剂盒包括下列组成：(1)DNA提取试剂；(2)恒温扩增反应液，包括：正向外围引物、反向外围引物、两条探针、两条扩增交叉引物、1×Thermol Buffer，MgSO4，dNTPs溶液，Bst DNA聚合酶和无菌双蒸水；所述正向外围引物为：5′‑AACAGTGCTCGTTTACGACC‑3′；反向外围引物为：5′‑CTGATCGATAATGCCAGACG‑3′；所述两条探针的序列分别为：正向5′端Biotin标记探针：5′‑Biotin‑AGGTAGGTAATGGAATGACGA‑3′；反向5′端Fitc标记探针：5′‑Fitc‑CGTTCTACATTGACAGAATCCTCAG‑3′；所述两条扩增交叉引物分别为：扩增正向引物：5′‑GCGATCAGGAAATCAACCAGATAGAATGGTGATGATCATTTCTAT GTTC‑3′；扩增反向引物：5′‑CGTACTGGCGATATTGGTGTTTATATTAACAGTACCGCAGGAAAC‑3′；(3)阳性对照：含有沙门氏菌invA基因的DNA质粒；(4)阴性对照：无菌双蒸水。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：徐昌平，余蓓蓓，卢亦愚，冯燕，须周恒，胡宗悦，
申请(专利权)人：浙江省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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