本发明专利技术公开了人干扰素IFN-α2a与人抗菌肽LL-37的基因改造、融合表达与纯化。所获得的IFN-α2a与LL-37融合蛋白同时具有IFN-α2a的抗病毒活性和LL-37的抗菌活性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程
技术介绍
蛋白融合技术，是通过DNA重组技术获得两个基因重组后的表达产物。现广泛用 于新的蛋白药物或新功能蛋白分子产品的开发。 蛋白融合的目的包括：一是使一种分子具有两种蛋白的功能。例如，将人B7-2分 子与英光蛋白融合表达，使新形成的融合蛋白同时具有B7-2分子的功能和英光蛋白的功 能。二是增加二种蛋白中某一蛋白的稳定性W提高其效率，例如将人干扰素蛋白与人血清 蛋白融合表达，就可W提高干扰在人体内的半衰期。Η是蛋白产物定向的需要。例如将信 号肤序列与目标蛋白融合表达，就可W实现产物的胞外表达。 目前干扰素均通过基因工程技术生产。α干扰素在生产和使用过程中存在的主要 问题一是基因工程菌产量低，生产成本高；二是α干扰素分子量小，容易被肾小球滤过，临 床应用时半期短，约每2天就需要重新用药一次。对于产量低的问题，目前主要通过优化表 达系统和发酵工艺方面着力。对于半衰期短的问题，目前常采取的方法包括PEG修饰W增 加分子量，掩盖分子表面的抗原决定簇和蛋白酶作用位点；同人白蛋白或免疫球蛋白Fc片 断融合增加分子量，减少肾小球滤过；在合适的位置引入糖基化掩蔽蛋白酶位点和增大分 子量等。很多病毒均具有诱发肿瘤的能力，因此同时具有抗病毒与抗肿瘤能力的α干扰在 此类疾病的治疗方面作用重要。同时，多数肿瘤患者由于其自身的免疫系统不同程度的受 到破坏，因此，还需特别预防细菌感染。基于临床需要同时抗菌、抗细菌和抗肿瘤的特点，将 人IFN-α2a与化-37经过按毕赤酵母的密码子偏好性进行优化，构建高产工程菌，在此基 础上生产出长效的Η联干扰素。
技术实现思路
1.人α-37与IFN-α2aDNA序列的密码子优化 在保证人化-37与IFN-α2a氨基酸序列完整性的前提下，按照P.pastoris对密 码子的偏好性特点，对他们的DNA序列进行优化。 2重组质粒构建 分别用EcoRI和NotI双酶切PPIC9K和pMD-18FaU-IFN质粒，经凝胶电泳后切 胶分别回收约9300bp利70化P的片断，用胶回收试剂盒回收片断，并用T41igase连接，构 建分泌型重组质粒pPIC9K-FaU-IFN，用化C1法转化大肠杆菌D册α，利用LB-Amp平板筛 选重组子。挑选阳性转化子送上海生工进行测序，确定质粒的结构。 3重组质粒转化毕赤酵母 用SacI单酶切pPIC9K-Fall-IFN成线性重组质粒，通过电击转化法将其转入 P.pastorisGS115 中构建重组菌P.pastorisGS115LI。电击条件为 1500kV，200Q，25uF。 转化液涂布于MD平板3(TC静止培养3天，挑选阳性克隆，摇瓶后，用真菌基因组提取试剂 盒提取基因组进行PCR鉴定。引物为；SensePl;TTCGCCTTGTTGGGTGACTTCTTC，AntisP2 ;TCACTCCTTAGATCTCAAAGACTC，退火温度为58°C，WGS115基因组及未加模板的体系为对照 组。 4重组菌表型鉴定及多拷贝筛选 通过甲醇利用情况进行重组菌表型鉴定。将PCR鉴定的阳性转化子编号，并将每 菌株用灭菌牙签同时接种MD和MM平板，3(TC静止培养5天，观察各菌株在两种平板上的生 长情况。 通过遗传霉素（G418)浓度梯度筛选多拷贝重组株。首先制备遗传霉素质量浓度 为0. 25、0. 5、1. 0、2. 0、3.Omg/mL的YPD平板，然后将前面筛选的表型正常的重组菌株用灭 菌牙签点在5个遗传霉素梯度平板上，3(TC静止培养4天，观察结果，能在高浓度下生长良 好的菌株为多拷贝菌株。 5融合蛋白发酵与纯化 将筛选的重组菌株，接种于25血BMGY培养液中，30°C250巧m/min培养约16h，至 菌液ODe。。W5,4°C4000巧m/min离必5min，收集菌体，用25血BMMY培养液重悬细胞，诱 导培养，每2地按体积比为0.5%加入纯甲醇，连续诱导14地^上，41：12000巧111/111111离必 5min，收集上清于-2(TC冻存待用。 上清液中的融合蛋白先用35%饱和度（NH4)2S04盐析，12000巧m/min离必收集盐 析沉淀，再将沉淀溶于0.8mol/L(NH4)2S04(P册.3)，上样化enパ-S巧haroseFF疏水柱，用 0. 5mol/L(NH4)2S〇4洗脱后透析除盐，样品浓缩后再上样DEAES巧hadexA-25阴离子交换柱， 义用0. 3mol/L化C1洗脱，收集含目的蛋白洗脱峰，浓缩后义用Se地acyal-HR200分子筛脱 盐，冷冻干燥得最终产品。 6IFN-α2a与Lレ37融合蛋白的检测[001引 6. 1融合蛋白纯度检测 用SDS-PAGE法检测融合蛋白纯度，检测参照文献进行。WTakara蛋白分子质量 标准（低）为Marker。W未经诱导的发酵液为空白对照。 6. 2融合蛋白浓度检测 W牛血清白蛋白为标准，按Low巧法测定融合蛋白浓度。 6. 3融合蛋白产物活性分析 培养液中IFN-α2a的活性分析参照《中国药典2010版》中《干扰素效价测定（细 胞病变抑制法）》。活性标准品购自广州市药品检测所。W总IFN-a2a活性计算纯化过程 中的回收率。 培养液中化-37的活性测定参照文献17。用大肠杆菌ATCC25922W及ML35p作 为检测菌种，用双层琼脂糖打孔法测定。底层培养基上打直径3mm的圆孔，每孔加10μL发 酵液，37°C赔化化后，在底层上覆盖一层营养琼脂，37°C继续培养20h，测量无菌生长的透 明环直径。抗菌活性W下式计算：抗菌活性单位扣）=(抗菌环直径-3)X10【附图说明】图1重组质粒pPIC9K-Fall-IFN构建过程图 2 重组P.pastorisGS115LI与原始菌P.pastorisGS115 基因PCR结果 1 道为 200bpmarker, 2、3、4、5 道为P.pastorisGS115LI, 6、7、8 为P.pastoris GS115。 图3经过诱导和未诱导的GSl巧LIl发酵液的SDS-PAGE。【具体实施方式】 下面结合附图和实施例子对本专利技术作进一步说明，但本专利技术并不限于此。 1IFN-α2a与α-37的密码子优化 自Genebank中查询，获得Homosapiensinterferonal地a2a序列，Sequence ID;gbIJN848522. 1，全长为567序列，按毕赤酵母密码子偏好性优化后，所得结果见SEQID No. 2。自Genebank中查询的人抗菌肤化-37基因，按毕赤酵母密码子偏好性优化后，所 得结果见沈QIDNO. 3。 2人化-37与IFN-α2a融合重组质粒的构建 经过优化的人化-37DNA序列（3'端不带终止密码子），通过4个甘氨酸和1个丝 氨酸与IFN-α2a柔性联结。重组质粒pPIC9K-FaU-IFN的构建过程见图1。将构建的质粒pPIC9K-FaU-IFN转入化感受态E.coliD册α，所挑选的阳性转化 子经摇瓶提取质粒，用EcoRI和Notl双酶切鉴定得到大小约为9300和690的两条片断，与 预期的结构一致。同时将质送样测序，得到的DNA序列与设计的结果一致。 3重组质料本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人干扰素IFN‑a2a与LL‑37的融合蛋白，其是：a)具有与SEQ ID No.1的1‑232位氨酸序列所示的肽链，或b)在SEQ ID No.1基础上通过缺失、突变、重组获得的具有人干扰素IFN‑α2a与LL‑37活性的多肽。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：万徐萍，
申请(专利权)人：广东紫金正天药业有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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