本发明专利技术公开了一种豇豆疫霉菌LAMP检测引物及其检测方法，专用于豇豆疫霉菌特异检测。主要采用设计了一种豇豆疫霉菌的LAMP引物，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形带。所发明专利技术的LAMP引物及其用法可被用于生产实践中豇豆疫病的快速、灵敏、准确的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为豇豆疫病的防治提供可靠的技术和理论依据。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术豇豆疫霉菌LAMP检测引物及其检测方法，专用于豇豆疫霉菌高灵敏度快速LAMP检测，同时可用于田间豇豆疫病的早期诊断和病菌的监测和鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域。
技术介绍
由5工豆疫霉菌Kinase)侵染所致的5工豆疫病是5工豆成株期主要病害，适宜发病温度为25-28 °C，并且随着雨水增多、湿度增大，病害亦趋严重，所以春季连续阴雨和梅雨期间是疫病高发期。其次，若通风不好、排水不良、施用不腐熟基肥或连作地，发病亦较重。其病原5工豆疫霉菌{Phytophthora vignae)是疫霉属卵菌，隶属于藻菌界，卵菌门，卵菌纲，霜霉目，腐霉科。目前为止，对该病害的检测诊断主要是症状诊断和病原分离鉴定。症状识别方法如下:(1)茎部发病症状:茎部发病多发生在节部，初呈水渍状，无明显边缘，病斑扩展绕茎一周后，表皮变褐色，病茎以上叶片迅速萎蔫死亡；(2)叶片发病症状:叶片发病初生暗绿色水渍状圆形病斑，边缘不明显，天气潮湿时，病斑迅速扩大，可蔓延至整个叶片，表面有明显的白色霉状物，引起腐烂，天气干燥时，病斑变淡褐色，叶片干枯；(3)豆荚发病症状:豆荚产生暗绿色水渍状病斑，边缘不明显，后期病部软化，表面产生白霉；病原菌鉴定方法如下:在培养茎上菌丝体生长茂密；菌丝无隔透明，粗4-7 μm ;菌丝膨大体不规则结节状。在皮氏液中形成大量孢子囊，孢囊梗不分枝，与菌丝无明显区别。孢子囊多为卵形，椭圆形或倒梨形，形状和大小变化较大，在PDA上为21-42 μ mX 10-19 μ m，平均 28.1 μ mX 16.3 μ m，在虹?病英上为 35-57 μ mX 25-38 μ m，平均 53.0 μ mX 33.8 μ m，长宽比值为1.4-2.2，平均1.65 ;绝大多数无乳突或无明显乳突，平均高0.57 μ m ;成熟后不脱落，具内层出现象。未见厚垣孢子。产生大量有性器官，藏卵器近球形，无色，直径24-38(平均28.4) μπι。雄器近球形，围生。卵孢子近球形，淡黄色，平滑，18-25 μ mX 14-24 μ m，平均23.0 μ mX 20.8 μ mD而关于虹疫霉菌的PCR分子检测国内外尚未见报道，传统的病原菌检测方法程序繁琐，所需时间长，且必须拥有病原菌详细的分类资料，满足不了病害控制中快速、灵敏、稳定的检测要求。因此，建立一套快速、灵敏、准确的豇豆疫霉菌检测技术非常必要且十分迫切。目前，对植物病害的传统检测鉴定方法是首先进行病菌分离，通过对已经分离并纯化的病菌进行培养，观察，完成形态上的鉴定工作。同时，将病原菌回接到植株中，进行致病性的验证。最后，对照已有的分类资料确定引起病害的病原菌的分类和地位。该法作为最基本的病原菌鉴定方法在一直以来被广泛使用，有着很强实用性，是病原菌的鉴定及病害检测的方法之一，但是该方法受人为因素和环境的影响，对操作者的实验技能和实际经验有很高的要求，十分耗时，无法达到快速检验的要求。免疫学检测技术(Immunological technology)具有操作简单、特异性强，以及检测时间短的优点，适合开发检测试剂盒。但其不能对检测对象进行扩增，所以灵敏度不及核酸检测技术高。另外，抗体的制作过程耗时、复杂，提高了检测的成本。这两点缺点限制了免疫学检测技术的推广使用。聚合酶链式反应(Polymerase Chain React1n，PCR)是一种利用DNA聚合酶在体外大量扩增靶序列的技术，该技术是病原检测最常规的方法之一，广泛应用于病原鉴定、变异检测等分子生物学研究。PCR检测技术灵敏度高、特异性强，已成为病原菌检测重要的技术之一，主要包括常规PCR、巢式PCR (Nest-PCR)和实时荧光定量PCR等，主要的缺点是需要依靠PCR等仪器设备，不利于基层生产上推广应用。环介导等温扩增(Loop-mediated Isthermal Amplificat1n，LAMP)技术是由日本科学家开发的一种最新的简便、快速、准确及廉价的核酸高效扩增方法(Notomi et al.，2000)o LAMP技术是一种新型的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下，可在短时间内使产物得到大量扩增，在短短的30min~60min内就能实现109~101(]倍的扩增，同时具有很高的灵敏度和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断，反应结束后用肉眼观察是否产生焦磷酸镁沉淀，即可判断靶序列是否存在。亦可在反应液中加入荧光指示剂，使反应结果的肉眼观察更加的方便、直观和可靠。LAMP技术操作简单、快速高效，而且检测特异性非常强，其最大的优势就是在恒温条件即可进行扩增反应，无需特殊实验设备，相较于普通PCR技术，其有很多优点。综上，目前病害检测方法主要采用传统的病原分离检测方法和分子检测等技术。传统检测方法耗时、耗力，且检测结果可靠性低，免疫学检测技术的灵敏度较低，且抗体的制作过程耗时、复杂，检测成本高，PCR技术虽然快速、准确，但需昂贵的仪器设备，检测成本高，不适宜在基层部门推广应用。而最近科学家们研发出的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplificat1n, LAMP)技术是一种高效率的核酸等温扩增方法，该方法短时间内实现产物的大量扩增，灵敏度比PCR高，且操作步骤简便，无需特殊设备，检测结果可由肉眼判断，极适合于在基层生产部门推广应用。基于环介导等温扩增(LAMP)技术，建立豇豆疫霉菌的LAMP检测技术，根据LAMP技术原理，选取豇豆疫霉菌的核糖体基因上的内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)革巴序列的6个区域，进而设计出4条特异性引物，通过对反应体系和反应条件的优化，以钙黄绿素(Calcein)的荧光显色指示剂作用，建立可视化LAMP检测技术。该体系对豇豆疫霉菌检测具有高的特异性与灵敏性。该技术是一种操作简单、灵敏度和特异性高的快速检测手段；无需特殊仪器设备，同时开发的快速检测试剂盒适合田间作物生产中开展实地检测与监测，从而保障作物健康生产及食品安全。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术中豇豆疫霉菌的传统检测方法所需周期长、检测方法特异性差，PCR检测需要依靠扩增仪等设备，且灵敏度低的问题，提供一种豇豆疫霉菌的LAMP检测引物以及结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏度高的检测方法。实现本专利技术的目的包括下列步骤: 1.LAMP引物的设计 根据豇豆疫霉菌核糖体内转录间隔区(rDNA-1TS)序列在疫霉菌种间高度变异和种内稳定性，采用PrimerExplorer V4软件设计了对5工豆疫霉菌具有特异扩增作用的LAMP检测引物，包括2条外引物(F3和B3)和2条内引物(FIP和BIP)，引物序列分别为:F3: CTTGGCTCTCTTCCTTCCG ；B3: TCCTCCATTAAACGCCGC ；FIP: TTCAAGGGACTCGCAGGCAG-TGTAGTCGGTGGATGGAGAC ；BIP: TTGCTCGAAAAGCGTGACGTTG-AGCAGACAAACTGGTCGC ； 2.豇豆疫霉菌快速检测体系的建立 LAMP检测:25 μ 1反应体系中F3和Β3引物浓度各为0.2 mmol/本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种豇豆疫霉菌LAMP检测引物，其特征在于：所述LAMP引物如下：F3: CTTGGCTCTCTTCCTTCCG；B3: TCCTCCATTAAACGCCGC ；FIP: TTCAAGGGACTCGCAGGCAG‑TGTAGTCGGTGGATGGAGAC；BIP: TTGCTCGAAAAGCGTGACGTTG‑AGCAGACAAACTGGTCGC。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：陈庆河，翁启勇，李本金，刘裴清，刘小丽，
申请(专利权)人：福建省农业科学院植物保护研究所，
类型：发明
国别省市：福建;35
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