本发明专利技术公开了一种快速检测制药用水中微生物的方法，包括如下步骤：将待测制药用水通过混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行后，将所得的混合纤维素酯膜置于平皿中，加入Trizol浸泡滤膜，浸泡完成后进行离心处理，取上清液2ul作为PCR反应模板进行PCR扩增后，加入纳米银粒子溶液混合，加入PBS缓冲溶液，5-15min后，观察颜色变化。本发明专利技术所用的纳米银粒子稳定剂为PCR反应引物，无需额外添加底物，方便简单；检测灵敏度较高，只需PCR过程有特异性片段产生，就能通过肉眼可见的溶液颜色变化对相应病原微生物进行定性，可以更快地确认制药用水中否存在污染，避免产品的生产中断。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种微生物检测方法，具体涉及。
技术介绍
微生物快速检测方法是微生物学中的一个快速发展的方向，无论是对食品，药品用水安全的监督和管理，都需要一种较为快速的微生物检测方法。目前，对于微生物菌含量的检测，主要是依照传统的方法，将待检测的对象，接种到适合的培养基中，进行培养，观察和计数。但是目前的这种方法由于需要长期的培养，需要数天，这对于需及时检测到待检对象中的含菌量是不利的。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了，能快速检测制药用水中微生物的含量，可以更快地确认制药用水中否存在污染，避免产品的生产中断。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为:，包括如下步骤:S1、将待测制药用水通过0.23-0.47 μ m混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行；S2、将步骤S1所得的混合纤维素酯膜置于平皿中，加入l-3ml Trizol浸泡滤膜7-13min，得混合液；S3、将步骤S3所得的混合液进行离心处理后，取上清液2ul作为PCR反应模板进行PCR扩增，PCR扩增的调节为:首先在95°C运行2min，之后40个PCR循环，每个循环包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；S4、取纳米银粒子溶液90 μ 1与步骤S3所得的产物10 μ 1混合，加入终浓度为3.5-13.5mM的PBS缓冲溶液，5_15min后，观察颜色变化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶标仪上测量500-760nm的吸光度值。其中，所述纳米银粒子溶液通过以下步骤制备所得:(1)将质量浓度为0.8-2.2mg/mL的氧化可德兰多糖溶液与摩尔浓度为10-110mmol/L的水溶性硝酸银溶液按体积比1: 1混合后在磁力搅拌下，超声水浴70-100 °C，恒温反应 0.5-2h ；(2)将步骤⑴所得的反应液冷至室温，用0.22_0.26μπι微孔滤膜过滤，30000-40000rpm离心0.5_lh，分散在丙酮和水的混合液中，去除过量的氧化可德兰多糖和硝酸银；(3)通过超声波振荡设备重新分散在水中的银纳米粒子，蒸馏水透析48h，即得纳米银粒子溶液。其中，所述PBC 缓冲液的成分为 139mmol/L NaCl、2.6mmol/LKCl、13mmol/LNa2HP04和 3mmol/L ΚΗ2Ρ04Ο其中，所述PBC缓冲液由ddH20配制。其中，所述平皿在使用前需要杀菌消毒。本专利技术将PCR反应产物加入到纳米银粒子溶液中。一定时间后，加入PBS缓冲溶液。由于用于PCR反应的引物能使纳米银粒子抵抗盐离子，导致纳米银粒子溶液没有颜色变化。当水体中存在引物对应的病原微生物，引物会被消耗，纳米银粒子就会重新暴露在盐离子下，从而发生聚集，最终造成溶液颜色发生变化。颜色的变化与水中病原微生物有关，故该专利技术可用于检测水中病原微生物的种类。本专利技术具有以下有益效果:所用的纳米银粒子稳定剂为PCR反应引物，无需额外添加底物，方便简单；检测灵敏度较高，只需PCR过程有特异性片段产生，就能通过肉眼可见的溶液颜色变化对相应病原微生物进行定性，可以更快地确认制药用水中否存在污染，避免产品的生产中断。【具体实施方式】为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。以下实施例中所使用的PBC缓冲液由ddH20配制，成分为139mmol/L NaCl、2.6mmol/L KCl、13mmol/L Na2HP04^P 3mmol/L KH 2P04，所使用的平皿在使用前需要杀菌消毒。所使用的纳米银粒子溶液通过以下步骤制备所得:(1)将质量浓度为0.8-2.2mg/mL的氧化可德兰多糖溶液与摩尔浓度为10-110mmol/L的水溶性硝酸银溶液按体积比1: 1混合后在磁力搅拌下，超声水浴70-100 °C，恒温反应 0.5-2h ；(2)将步骤⑴所得的反应液冷至室温，用0.22_0.26μπι微孔滤膜过滤，30000-40000rpm离心0.5_lh，分散在丙酮和水的混合液中，去除过量的氧化可德兰多糖和硝酸银；(3)通过超声波振荡设备重新分散在水中的银纳米粒子，蒸馏水透析48h，即得纳米银粒子溶液。实施例1S1、将待测制药用水通过0.35 μ m混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行；S2、将步骤S1所得的混合纤维素酯膜置于平皿中，加入2ml Trizol浸泡滤膜lOmin，得混合液；S3、将步骤S3所得的混合液进行离心处理后，取上清液2ul作为PCR反应模板进行PCR扩增，PCR扩增的调节为:首先在95°C运行2min，之后40个PCR循环，每个循环包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；S4、取纳米银粒子溶液90 μ 1与步骤S3所得的产物10 μ 1混合，加入终浓度为8.5mM的PBS缓冲溶液，lOmin后，观察颜色变化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶标仪上测量630nm的吸光度值。实施例2S1、将待测制药用水通过0.47 μ m混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行；S2、将步骤S1所得的混合纤维素酯膜置于平皿中，加入3ml Trizol浸泡滤膜7min，得混合液；S3、将步骤S3所得的混合液进行离心处理后，取上清液2ul作为PCR反应模板进行PCR扩增，PCR扩增的调节为:首先在95°C运行2min，之后40个PCR循环，每个循环包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；S4、取纳米银粒子溶液90 μ 1与步骤S3所得的产物10 μ 1混合，加入终浓度为13.5mM的PBS缓冲溶液，5min后，观察颜色变化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶标仪上测量760nm的吸光度值。实施例3S1、将待测制药用水通过0.23 μ m混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行；S2、将步骤S1所得的混合纤维素酯膜置于平皿中，加入lml Trizol浸泡滤膜13min，得混合液；S3、将步骤S3所得的混合液进行离心处理后，取上清液2ul作为PCR反应模板进行PCR扩增，PCR扩增的调节为:首先在95°C运行2min，之后40个PCR循环，每个循环包括95°C 10s，和 60°C 34s ;之后 95°C lmin ；55°C 30s ；95°C 30s ；S4、取纳米银粒子溶液90 μ 1与步骤S3所得的产物10 μ 1混合，加入终浓度为3.5mM的PBS缓冲溶液，15min后，观察颜色变化，另取100 μ 1混合溶液加入96微孔板于酶标仪上测量500nm的吸光度值。以上所述仅是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。【主权项】1.，其特征在于，包括如下步骤: 51、将待测制药用水通过0.23-0.47 μ m混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行； 52、将步骤S1所得的混合纤维素酯膜置于平皿中，加入l_3mlTriz本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种快速检测制药用水中微生物的方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、将待测制药用水通过0.23‑0.47μm混合纤维素酯膜，直至抽滤无法进行；S2、将步骤S1所得的混合纤维素酯膜置于平皿中，加入1‑3ml Trizol浸泡滤膜7‑13min，得混合液；S3、将步骤S3所得的混合液进行离心处理后，取上清液2ul作为PCR反应模板进行PCR扩增，PCR扩增的调节为：首先在95℃运行2min，之后40个PCR循环，每个循环包括95℃10s，和60℃34s；之后95℃1min；55℃30s；95℃30s；S4、取纳米银粒子溶液90μl与步骤S3所得的产物10μl混合，加入终浓度为3.5‑13.5mM的PBS缓冲溶液，5‑15min后，观察颜色变化，另取100μl混合溶液加入96微孔板于酶标仪上测量500‑760nm的吸光度值。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：高显会，张慧影，张国毅，葛晓燕，
申请(专利权)人：辽宁医学院，
类型：发明
国别省市：辽宁;21
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