本发明专利技术涉及一种腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体，该突变体是由野生型人低氧诱导因子1α蛋白质的第402位脯氨酸（Pro）、第564位脯氨酸（Pro）、第803位天冬酰胺（Asn）、第532位赖氨酸（Lys）以及第551位丝氨酸（Ser）、第555位苏氨酸（Thr）、第589位丝氨酸（Ser）均突变为丙氨酸（Ala）而得。在常氧条件下，该突变体的降解速度要明显低于野生型的降解速度，具有更加稳定的特性，且能明显促进创伤修复。本发明专利技术还涉及该腺相关病毒介导的人低氧诱导因子1α突变体在制备具有创伤修复功能药物、用于促进血管新生或者改善缺血的药物、用于提高人低氧诱导因子1α蛋白质在常氧条件下的稳定性药物中的用途。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因工程
，具体涉及一种腺相关病毒介导的人低氧诱导因子 1α突变体及其在制备具有创伤修复功能、促进血管新生或者改善缺血等药物中的用途。
技术介绍
1998年美国费城威斯特研究所的EllenHeber-Katz教授的实验室发现了一种 小鼠MurphyRothsLarge(MRL)，在其耳朵上打孔后，其耳朵上的组织会在4周内自动再 生，让耳洞消失，恢复到打孔前的状态，并不留下疤痕。二十多年来这个研究团队一直在寻 找这种小鼠拥有罕见再生机能的原因。近日，该研究团队发现，一个功能强大的调节蛋白， 低氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactor-1a，HIF_la)，参与MRL小鼠组织的再 生。提高HIF-1α的表达水平，能使小鼠的伤口迅速愈合，甚至再生耳组织中还有含有软骨 和毛囊（YongZhangetal.，2015)。关于HIF家族促进组织修复和重塑的报道还有很多， 如能帮助肾脏细胞和组织修复（Bernhardtetal·，2006;Weidemannetal·，2008;Ma etal·，2009;JianpingPengetal·，2011)。HIF-1α是关键性成血管因子，能够显著 增强血管的再生和重建（PajusolaKetal·，2005;SarkarKetal·，2009;ChangElet al. , 2007;Bosch-MarceMetal. , 2007;RajagopalanSetal.,2007)〇 HIF-1α是一种氧调节分子，无论是表达水平、蛋白质的稳定性，还是促转录活性 都受到机体内氧浓度和各种细胞内外信号的调控，HIF-1α成为影响HIF-1作用的主要因 子，然而HIF-1α是氧气敏感的亚基，其半衰期在常氧状态下通常不超过5分钟。 影响HIF-1α稳定性的主要原因在于：1) 一些翻译后修饰作用，如羟基化、乙酰 化、磷酸化以及S-亚硝基化反应会影响HIF-1α蛋白质稳定性和转录活性；2)HIF-1α可 以通过依赖于泛素-蛋白酶体途径和不依赖于泛素-蛋白酶体途径被降解。常氧状态下， 氧敏感的脯氨酸羟化酶1，2,3 (PHDsl-3)处于激活状态，可以促使HIF-la氧依赖降解结 构域（ODD)的402和/564位点的脯氨酸残基发生羟基化修饰，导致HIF-1α与特异的E3泛 素连接酶-肿瘤抑制蛋白pVHL(vonHippel-Lindau)结合，并通过泛素-蛋白酶途径降 解。同时，羟化酶还可以作用于HIF-la转录激活区803位点的天冬酰胺残基（Asn803)，通 过HIF-1α抑制因子（FIH)抑制HIF-1α与辅助激活因子（CBP/P300)结合，从而抑制其转 录活性。除了羟基化修饰，HIF-1α的ODD结构域的赖氨酸位点（Lys532)还可以被一种称 为ARD1的乙酰转移酶修饰，这种修饰能增加常氧条件下HIF-1α与PVHL的相互作用，从而 促进它的泛素化和降解。磷酸化作用对HIF-la的转录活性和稳定性均有影响，HIF-la 的磷酸化水平主要是由两条激酶的磷酸化活化通路决定的：P42/P44丝裂源激活的蛋白激 酶(MAPK)通路和磷酸肌醇-3-激酶（PI3K)通路，前者主要是对HIF-1α转录活性产生影 响，后者不仅对HIF-1α的转录活性产生影响，而且还对其蛋白质稳定性产生影响，PI3K/ Akt通路不能直接磷酸化HIF-la，而是通过mTOR(mammaliantargetofrapamycin)或 GSK3(glycogensynthasekinase3)来调节，GSK3能使HIF-1α磷酸化而被蛋白酶体识别 并降解，影响其稳定性，目前，HIF-1α的Ser551、Thr555和Ser589位点已被证实是ΡΙ3Κ/ Akt/GSK3 途径的磷酸化位点（D.Mottetetal·，2003 ;D.Flugeletal·，2007 ;S.E.Schnitzeretal. , 2005)。 常氧条件下降低HIF-1α降解速度的方式主要是添加PHD、FIH和ARD1蛋白酶活 性抑制剂来避免HIF被蛋白酶体降解，从而调节HIF稳定性和/或活性，如：1)WanjaΜ. 等人利用FG-4487抑制PHD活性，从而增加HIF稳定性；2)CN101664553Β低氧诱导因子 (HIF)α的稳定化，通过加入杂环羧酰胺化合物抑制HIF脯氨酰羟化酶活性来稳定HIFα 亚基（HIFa) ;3)CN102272117Β作为HIF羟化酶抑制剂的苯并噻喃衍生物，通过加入苯 并噻喃衍生物来抑制HIF羟化酶活性，从而提高HIF稳定性。 除此以外，通过基因工程手段，直接将有可能影响HIF稳定性的羟基化、乙酰化、 磷酸化等位点的氨基酸突变为其他氨基酸，从而增加HIF的稳定性。目前，突变的氨基酸位 点主要是第402位脯氨酸（Pro)、第564位脯氨酸（Pro)和第803位天冬酰胺（Asn)，以下 简称HIF-?α3mut。如：1)CN101307102A人低氧诱导因子Ια重组腺病毒载体及其应 用，将野生型HIF-1α蛋白质在常氧条件下发生羟基化的第402位、第564位脯氨酸（Pro) 和第803位天冬酰胺（Asn)突变为其他氨基酸，防止HIF-1α通过泛素-蛋白酶系统降解。 2)JiajiaXie等人将野生型HIF-la蛋白质在常氧条件下发生羟基化的第402位、第564 位脯氨酸（Pro)和第803位天冬酰胺（Asn)突变为丙氨酸，突变型HIF-1α的半衰期要长于 野生型HIF-la。除此以外，还未见有其他氨基酸突变位点。 腺相关病毒（AAV)是一类微小、无被膜及具有二十面体结构的细小单链DNA病毒， 具有安全性好、宿主范围广、免疫源性低、在体内表达外源基因时间长、物理性质稳定等特 点，被视为最有前途的基因转载体之一。
技术实现思路
本专利技术的首要目的是提供一种HIF-1α的突变体，将影响HIF-1α稳定性的羟基 化位点、乙酰化位点、磷酸化位点的氨基酸突变为其他氨基酸，以期获得在常氧条件下稳定 高活性的HIF-la突变体，为以后的临床应用打好基础。为实现此目的，本专利技术人将野生型 HIF-1α蛋白质的第402位脯氨酸（Pro)、第564位脯氨酸（Pro)、第803位天冬酰胺（Asn)、 第532位赖氨酸（Lys)以及第551位丝氨酸（Ser)、第555位苏氨酸（Thr)、第589位丝氨酸 (Ser)均突变为丙氨酸（Ala)，在常氧条件下，该HIF-la突变体的降解速度要明显低于野 生型HIF-1a，具有更加稳定的特性。 本专利技术的第二个目的是提供该HIF-1α突变体的核苷酸序列。 本专利技术的第三个目的是提供构建HIF-la突变体的高效表达载体，优选是病毒载 体，更优选是腺相关病毒载体。 本专利技术的第四个目的是提供含有本专利技术核苷酸序列或者本专利技术载体的宿主细胞。 本专利技术的最后一个目的是提供腺相关病毒介导的HIF-1α突变体在制备具有创 伤修复功能药物、用于促进血管新生或者改善缺血的药物、用于提高HIF-1α蛋白质在常 氧条件下的稳定性药物中的用途。 本专利技术的有益效果在于：在常氧条件下，本专利技术公开的HIF-la突变体的降解速 度要明显低于野生型的降解速度，具有更本文档来自技高网...
【技术保护点】
人低氧诱导因子1α突变体，其特征在于该突变体是由野生型人低氧诱导因子1α蛋白质的第402位脯氨酸（Pro）、第564位脯氨酸（Pro）、第803位天冬酰胺（Asn）、第532位赖氨酸（Lys）以及第551位丝氨酸（Ser）、第555位苏氨酸（Thr）、第589位丝氨酸（Ser）均突变为丙氨酸（Ala）而得。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：周勇，申友锋，
申请(专利权)人：重庆高圣生物医药有限责任公司，
类型：发明
国别省市：重庆;85
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