本发明专利技术提供了一种发酵高产DHA的方法，该方法包括利用含强氧化剂的培养基驯化裂殖壶菌菌种，利用发酵培养基培养经驯化的菌种，以此发酵高产DHA。其中，驯化后的菌种经发酵，DHA含量到达57.9%，产油效率达到0.492g/L/h，分别比对照提高了约20%，55%。本驯化方法不涉及基因工程方法，不危害环境，不增加人力物力，简单、方便且具有经济效益。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，设及裂殖壶菌菌种的驯化W及利用驯化的菌种进行 DHA生产的方法。
技术介绍
二十二碳六締酸（22:6n-3)，简称DHA，是ω-3系列中一种重要的多不饱和脂肪酸 (polyunsaturatedfattyacid,PUFA)eDHA不仅是婴幼儿大脑、视觉正常发育的必需物质， 而且还具有延缓老年人大脑和视觉功能衰退和降低血脂、抑制血栓生成、抗自身免疫反应、 抑制肿瘤等功效，因此被誉为"脑黄金"。目前，DHA已广泛用于婴幼儿食品、保健食品和辅 助治疗剂等产品。[000引 目前，传统鱼油来源的DHA油脂由于易受环境、季节等的影响，导致DHA产量有限； 而且，鱼油具有胆固醇和其它不饱和脂肪酸含量高，分离纯化困难的缺点。因此，利用微生 物发酵制备DHA油脂越来越受到关注。能够合成DHA的微生物主要是一些低等海洋真菌和 微藻，如破囊壶菌、裂殖壶菌、隐甲藻等。而裂殖壶菌（Schizochytriumsp.)作为海洋真菌， 因其具有发酵周期短，生产DHA油脂能力强等的优点，而成为当前微生物发酵产DHA的常用 菌种。裂殖壶菌合成的脂肪酸组分较为单一，总脂含量达20%，其中DHA占45%左右，其它 不饱和脂肪酸百分率小于1%，因此利用裂殖壶菌生产DHA具有广大的市场前景。 目前，关于微生物发酵产DHA的现有技术主要包括两个方面：1、DHA生产菌株的诱 变筛选方法，如中国海洋大学的（海洋真菌裂殖壶菌0UC88的工业应用）（中国专利申请CN 200410075426.讶；南京工业大学的一种二十二碳六締酸生产菌株及其诱变筛选方法及其 应用（中国专利申请CN200910033493.8)等；2、关于培养基的组成，如南京工业大学的一 种裂殖壶菌及利用其生产DHA油脂的方法（200910033869.5)等。传统的发酵调控过程难 W稳定控制，并且发酵调控主要针对油脂含量的提高，没有从根本上提高DHA含量。而菌种 的传统改造主要都通过诱变筛选的方法，此方法由于缺乏针对高DHA含量菌种的筛选培养 基，造成筛选工作盲目，因此，菌种筛选工作量较大，而筛选效果却往往不够理想。因此新的 菌种选育方法，对提高裂殖壶菌中DHA含量具有重要意义。
技术实现思路
针对现有方法中，菌种选育过程相对盲目的技术问题。本专利技术通过提供一种驯化 裂殖壶菌的方法，来实现DHA的高产。 具体的，本专利技术的技术方案为： 一种驯化裂殖壶菌菌种的方法，其中，在驯化培养基中添加了强氧化剂。本专利技术 中，可W理解为，驯化裂殖壶菌的方法通过将裂殖壶菌在含有强氧化剂的培养基中培养驯 化实现。[000引本专利技术所述的方法，其中，所述驯化培养基配方包括碳源、氮源、无机盐离子和微 量元素；其中，碳源为葡萄糖；氮源为酵母粉；无机盐离子为钢盐、儀盐、钟盐、憐酸盐和巧 盐中的任意一种或多种；微量元素为Mn2\Co2\Ni2+和化2+中的任意一种或多种。 本专利技术所述的方法，其中，驯化的具体步骤为： (1)在活化培养基中活化菌种； 1] 似在添加强氧化剂的驯化培养基中，接种经活化的菌种，培养生长至驯化培养体 系中的细胞干重达到25g/L; (3)将步骤（2)得到的驯化菌种接入不含强氧化剂的种子培养基中，培养生长至 体系中的细胞干重达到25g/L; (4)提高驯化培养中强氧化剂的浓度，接种经步骤（3)得到的驯化菌种，培养生长 至驯化培养体系中的细胞干重达到25g/L;(5)循环步骤（2)、（3)和步骤（4)，直至驯化菌种能够在含有强氧化剂质量浓度为 0. 1 %的驯化培养基中正常生长至细胞干重25g/L。本专利技术所述的方法，其中，循环步骤（2)、（3)和步骤（4)的次数为2次W上。对于 该循环此次的定义，应理解为，每循环操作培养一次，驯化培养基中强氧化剂的浓度提高一 次，直至到最高的强氧化剂浓度。优选为3次，4次，5次，6次。 本专利技术所述的方法，其中，步骤似中第一次添加强氧化剂的初始质量浓度含量 为 0.01%。 本专利技术所述的方法，其中，步骤（4)所述循环步骤中，强氧化剂的质量浓度优选依 次控制为：〇. 02%，0. 03%，0. 04%，0. 05%，0. 06%，0. 07%，0. 08%，0. 09%，0. 1%。[001引本专利技术所述的方法，其中，步骤似、（3)和步骤（4)中，所述接种的接种量为培养 基体积的0.2~2%。 本专利技术所述的方法，其中，所述强氧化剂为高儘酸钟或过氧化氨。 本专利技术所述的方法，其中，所述强氧化剂的除菌方式为膜过滤。其中膜过滤的方式 即为，将强氧化剂配制为相应浓度要求的溶液，然后通过膜过滤可W去除污染细菌，使得过 滤后的溶液符合裂殖壶菌培养的要求。 一种发酵高产DHA的方法，其中，采用上述任一权利所述方法获得的菌株进行DHA 发酵、提取，获得含DHA的油脂。目P，利用驯化的菌种进行扩大培养发酵，最终获得裂殖壶菌 菌体，并提取油脂。对于菌株的选择，可W是能够耐受质量含量0. 1%强氧化剂且在培养时， 生长细胞干重已经超过25g/L的菌株；也可W是耐受更低强氧化剂质量含量浓度的菌株。 更进一步的，在一个整体优选的方案中，方法包括如下步骤： (1)将裂殖壶菌菌种的活化 (2)在强氧化剂质量浓度为0. 01%的过氧化氨溶液的驯化培养基中，接入活化后 的裂殖壶菌菌种；驯化数天，待裂殖壶菌生物量生长至25g/lW上。(3)将步骤（2)获得的菌种接入不含强氧化剂的种子培养基中，培养生长至体系 中的细胞干重达到25g/L; (4)将步骤（3)获得的菌种接入强氧化剂质量浓度为0. 02 %的过氧化氨溶液的驯 化培养基中，培养生长至体系中的细胞干重达到25g/L; (5)如此不断逐步提高强氧化剂添加浓度，重复2, 3步骤长期驯化，直到驯化菌种 能够在含有0. 1%强氧化剂培养基中正常生长，其中，驯化培养基中的强氧化剂浓度依次控 制为 0. 03%，0. 04%，0. 05%，0. 06%，0. 07%，0. 08%，0. 09%，0. 1%。。 (6)利用能够耐受质量含量0.1%强氧化剂且在培养时，生长细胞干重已经超过 25g/L的菌株进行扩大培养发酵，最终获得裂殖壶菌菌体，并提取油脂。 步骤（1)中，原始菌种的活化方法为：将具有合成DHA能力的微生物接种于种子 培养基中，25Γ培养24小时，待种子生长至对数期。其中，所述的种子培养基包括碳源、氮 源、无机盐离子和微量元素，其中碳源为葡萄糖，氮源为酵母粉，无机盐离子为钢盐、儀盐、 钟盐、憐酸盐和巧盐中的任意一种或多种，微量元素为Mn2\Co2\Ni2+和化2+中的任意一种 或多种。 步骤似中，将活化的种子接入含有0. 02 %强氧化剂培养基中，接种量为1% -3% (v/v)，25°C培养24小时，过氧化氨的除菌方式为膜过滤。 步骤（4)中，菌种适应强氧化剂环境的指标为种子液干重达到25g/l， 步骤巧）中，发酵方法为：将种子液接种于发酵培养基中， 发酵培养基配比为：葡萄糖80~lOOg/L、酵母膏4~6g/l、1拆04 · 7肥0 3~ 5邑/1、化25046 ~9g/L、（畑4) 2S042 ~4g/l、KC1 0. 1 ~0. 5g/L、谷氨酸钢 17 ~20g/l、 K肥P042~4g/L本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种驯化裂殖壶菌菌种的方法，其特征在于：在驯化培养基中添加了强氧化剂。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：黄和，孙小曼，任路静，纪晓俊，
申请(专利权)人：南京工业大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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