本发明专利技术公开了一种基于sanger测序人线粒体基因组的方法，所述方法包括如下步骤：人总DNA提取；根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序设计覆盖线粒体全长的引物对，对人总DNA进行PCR扩增；回收PCR扩增产物，获得人线粒体特定的基因片段；对所述基因片段进行测序；用CExpress对测得的序列根据引物对与引物对之间的序列重叠区进行拼接，组装得到人线粒体全序列。本发明专利技术只需提取人总DNA，避免了提取较高纯度mtDNA繁琐的实验操作过程，然后根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序列设计覆盖线粒体全长的引物对，对总DNA进行扩增，得到线粒体特定的基因片段，进行测序，减少了对于总DNA测序的数据量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及基因工程领域，具体设及一种基于sanger测序人线粒体基因组的方 法。
技术介绍
线粒体自发现W来，其形态结构，基因组成，复制，转录与翻译，与核基因组的关 系，W及其遗传特点，进化特点和分子系统学方面都积累了大量的资料。线粒体是真核细胞 内重要的细胞器，能量生成的场所，还参与脂肪酸的合成及某些蛋白质的合成。线粒体DNA 是细胞内相对独立的基因组。线粒体DNA是细胞内较小而又较易纯化的复制转录单位，基 因组结构比较简单，并具有很高的专一性，独特性，它的传递、重组、分离、复制、转录都可应 用分子生物学的许多手段和方法进行分析。因此，线粒体DNA不仅是研究DNA结构与DNA复 审IJ、转录的良好模型，也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成等一般问题非合适的模型系统。 从Anderson等（1981)测定人线粒体基因组的全序列W来，人线粒体是一条共价闭合的双 链DNA，分子量较小，长度为16569个碱基。人线粒体基因组共含有37个基因。22个tRNA 基因，细胞色素b基因（切忧）、细胞色素氧化酶3个亚基基因（C0I，C0II，C0III)，NADH氧化 还原酶7个亚基基因（NDl，ND2，ND3，ND4，ND化，ND5，ND6)和ATP酶2个亚基基因（ATPase6， ATPaseS)，一个 12SrRNA基因，一个 16SrRNA基因。 线粒体DNA的突变与许多人类疾病相关，由线粒体DNA突变引起的一类疾病被称 为线粒体疾病。从分子生物学的角度研究线粒体疾病可W掲示疾病的发生、发展及其遗传 规律，从而为疾病的诊断、治疗及预防提供科学依据。目前研究发现的线粒体疾病主要有 Lerber'S遗传性视神经病、线粒体脑肌病、母系遗传的糖尿病和耳聋等。 现有多种线粒体基因测序方法，如基于克隆文库的sanger测序法，基于PCR预扩 增或者提取mtDNA的高通量测序法、基于总DNA的高通量测序法等，运些测序方法关键是在 于获得较高纯度的mtDNA，或是需要测序的原始数据量较高。但是获得较高纯度的mtDNA， 操作比较繁琐，实验过程稍有不慎，得到的mtDNA会有核DM污染，大量的原始数据量会大 幅度增加测序的工作量。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述现有技术存在的不足，提供一种基于sanger测序人 线粒体基因组的方法。 本专利技术的目的是通过W下技术方案来实现的： 本专利技术设及一种，所述方法包括如下步 骤： S1、人总DNA提取； S2、根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序设计覆盖线粒体全长的引物对，对人 总DNA进行PCR扩增； S3、回收PCR扩增产物，获得人线粒体特定的基因片段； W11] S4、对所述基因片段进行测序；用CExpress对测得的序列根据引物对与引物对之 间的序列重叠区进行拼接，组装得到人线粒体全序列。 优选的，步骤S2中，所述引物对包括如SEQIDNO. 1所示的服-12S-F和如SEQID NO. 2所示的服-12S-R构成的引物对，如沈QIDNO. 3所示的服-16S-F和如沈QIDNO. 4 所示的服-16S-R构成的引物对，如SEQIDNO. 5所示的服-Cl-F和如SEQIDNO.6所示的 服-Cl-R构成的引物对，如沈QIDNO. 7所示的服-C2-F和如沈QIDNO.8所示的服-C2-R 构成的引物对，如SEQIDNO. 9所示的服-N2-F和如SEQIDNO. 10所示的服-N2-R构成的 引物对，如SEQIDNO. 11所示的服-CB-F和如SEQIDNO. 12所示的服-CB-R构成的引物 对，如SEQIDNO. 13所示的服-C3-F和如SEQIDNO. 14所示的服-C3-R构成的引物对，如 沈QIDNO. 15所示的服-N4-F和如沈QIDNO. 16所示的服-N4-R构成的引物对，如沈QID NO. 17所示的服-N5-F和如沈QIDNO. 28所示的服-N5-R构成的引物对，如沈QIDNO. 19 所示的服-12S-S和如SEQIDNO. 20所示的服-16S-C构成的引物对，如SEQIDNO. 21所 示的服-N2-S和如SEQIDNO. 22所示的服-Cl-C构成的引物对，如SEQIDNO. 23所示的 监-Nl-F和如沈QIDNO. 24所示的服-Nl-R构成的引物对，如沈QIDNO. 25所示的服-CB-S 和如SEQIDNO. 26所示的服-12S-C构成的引物对，如SEQIDNO. 27所示的服-C2-S和如 沈QIDNO. 28所示的服-C3-C构成的引物对，如沈QIDNO. 29所示的服-C3-S和如沈QID NO. 30所示的服-N4-C构成的引物对，如沈QIDNO. 31所示的服-N4-S和如沈QIDNO. 32 所示的服-N5-C构成的引物对，如SEQIDNO. 33所示的服-N5-S和如SEQIDNO. 34所示的 监-CB-C构成的引物对，如沈QIDNO. 35所示的监-Cl-S和如沈QIDNO. 36所示的服-C2-C 构成的引物对，如SEQIDNO. 37所示的服-16S-S和如SEQIDNO. 38所示的服-Nl-C构成 的引物对。 阳01引优选的，步骤S2中，所述PCR扩增中，每50.Oul扩增反应体系包括：基因组DNAl.Oul，含 2. 5mMMg化的 10XLABuffer5. 0ul，5u/yL的LATaq聚合酶l.OuiaOmM 的dNTP1.Oul，lOuM的正向引物1.加1，lOuM的反向引物1.加1，d地20 39.Oul。 优选的，步骤S2中，所述PCR扩增中，PCR反应参数为：预变性95 °C，5min;变性 95°C，30s;退火 55°C，45s;延伸 72°C，lmin30s;终延伸 72°C，7m;循环数 45。 优选的，步骤S3中，所述回收是用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行回收。 优选的，步骤S4中，所述测序是基于Sanger双脱氧链终止法进行一代测序。 优选的，步骤S4还包括对于组装得到的人线粒体全序列根据已经测出的人线粒 体序列进行方向的确定和零点基因的确定的步骤。 优选的，所述方向的确定为：确定基因方向跟其它人线粒体序列是否一致，如果一 致，则不需要调整方向，否则，需要把序列反向互补。 优选的，所述零点基因的确定为：在确定了线粒体序列方向的基础上，把第一个基 因的起始位置作为第一个碱基，其他序列按顺序排列。 本专利技术的方法的基本原理是通过已知人线粒体序列设计出覆盖线粒体全长的引 物对，分段扩增线粒体特定的基因片段，然后用ABI3730x1测序仪测出运些基因的序列， 然后通过序列与序列之间的重叠区将运些序列拼接成一个完整的线粒体。 与现有技术相比，本专利技术具有如下有益效果： 阳02引本专利技术只需提取人总DM,避免了提取较高纯度mtDNA繁琐的实验操作过程，然后 根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序列设计覆盖线粒体全长的引物对，对总DNA进行扩 增，得到线粒体特定的基因片段，进行测序，减少了对于总DNA测序的数据量。【附图说明】 图1为测得的序列根据引物对与引物对之间的序列重叠区进行拼接的效果示意 图。【具体实施方式】 下面结合实施例对本专利技术进行详细说明。W下实施本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于sanger测序人线粒体基因组的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：S1、人总DNA提取；S2、根据NCBI数据库中已测出的人线粒体序设计覆盖线粒体全长的引物对，对人总DNA进行PCR扩增；S3、回收PCR扩增产物，获得人线粒体特定的基因片段；S4、对所述基因片段进行测序；用CExpress对测得的序列根据引物对与引物对之间的序列重叠区进行拼接，组装得到人线粒体全序列。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙子奎，王锋，丁方美，李嫦娥，方婉，
申请(专利权)人：上海派森诺生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31
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