本发明专利技术公开了一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，该方法包括以下步骤：将iPS细胞消化后吹吸分散成单个细胞悬液，分种在培养孔中，每孔加入ROCK抑制剂；分种后的第一天，吸弃上清液，加入神经诱导完全培养基，培养直至获得P1代的神经干细胞；将P1代的神经干细胞接种到神经元诱导培养基中培养，培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；2天后，将培养基更换为添加低浓度的雷帕霉素以促进自噬的神经元细胞分化培养基，培养至12-15天可诱导分化为神经元细胞。本发明专利技术方法可加快神经元的诱导分化形成，并且改善了脊髓小脑共济失调三型iPS的神经元生长状态。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术设及，该方法通过增 强自隧提高诱导分化效率。
技术介绍
神经元是一种不可再生的细胞，因此在人类一些损伤神经元的疾病中，会产生一 些不可逆的后果。随着人类寿命的延长，阿尔茨海默病、脑血管意外等神经元受累的疾病增 加，而人的诱导多能干细胞可诱导分化为有功能的神经元，该技术为治疗运一类疾病提供 了可能性。但是从诱导多能干细胞或者胚胎干细胞诱导分化为神经元需要繁杂的过程，如 设及悬浮培养或者外源细胞共培养的方法。运些方法均有操作繁琐及耗时长等缺点。而 化ury-stewart等使用一些小分子，很好地解决了悬浮及外源细胞共培养等问题。Life公 司也有相关的试剂盒产品解决了运一问题。但是从诱导多能干细胞或者胚胎干细胞诱导为 神经元需要数周，耗时长的问题仍未得到很好的解决。因此亟需一种简便快捷的方法进行 神经分化。[000引 自隧（auto地agy)是一个吞隧自身细胞质蛋白或细胞器并使其包被进入囊泡，并 与溶酶体融合形成自隧溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程，藉此实现细胞本身的代谢 需要和某些细胞器的更新。 脊髓小脑性共济失调（SpinocerebellarAtaxia,SCA)是一组遗传异质性很大的 神经系统变性疾病。ATXN3基因编码ATAXIN-3蛋白，该基因CAG拷贝数动态突变时，其编码 的蛋白簇基端多聚谷氨酷胺（polyglutamine，化ly曲链异常扩展W及蛋白质的异常聚集， 引起细胞功能障碍，从而引起神经毒性而致病。除了传统的泛素蛋白酶降解系统，自隧是真 核细胞中一种高度保守的、通过溶酶体机制途径发挥作用的降解通路，与神经退行性疾病 等疾病密切相关。研究表明诱导自隧能够降解聚集突变的ATAXIN-3蛋白，从而防止SCA3/ MJDW及其他神经退行性疾病的发生。SCA3诱导多能干细胞是很好的研究SCA3发病的工 具。但是自隧在SCA3诱导多能干细胞诱导分化为神经元中起到的作用尚需明确。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种促进人诱导多能干细胞 向神经元诱导分化的方法。 本专利技术的目的通过下述技术方案实现： -种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，包括W下步骤：[000引 （1)融合度70-80%的人诱导多能干细胞（iPS细胞），加入预热的细胞消化液后 37°C解育5分钟，接着用移液管吹吸若干次，使细胞分散成单个细胞悬液，然后将细胞分种 在培养孔中；每孔加入ROCK抑制剂后放入37°C、5%C02的培养箱中培养； (2)分种后的第一天，吸弃培养孔的上清液W除去未贴壁的细胞，加入预热的 G化CX)'K神经诱导完全培养基，置于培养箱中继续培养；此后隔天换液，分种后第屯天可获 得PO代的神经干细胞（NSCs)，继续培养3-4天获得PI代的神经干细胞； (3)将聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿置于37°C、5%C〇2的培养箱中培养 比，接着在培养皿中添加神经元诱导培养基，再将步骤（2)传代后的P1代的神经干细胞接 种到培养皿中，接种密度为2. 5X104 - 5X104个细胞/cm2;神经元诱导培养基中要添加雷 帕霉素W促进自隧的发生；培养2天后，将培养基更换为神经元细胞分化培养基，每3 - 4天 更换一次培养基，培养至12-15天可诱导分化为神经元细胞； 步骤（1)所述的人诱导多能干细胞是在无滋养层条件下培养得到的无分化或者 仅含少量分化的克隆；所述的无滋养层条件，如使用Essential8?培养基WVitronectin 或Geltrex''作为基质； 本专利技术所述的人诱导多能干细胞是W人体的皮肤细胞为材料，利用episomal reprogrammingassay(Invitrogen,USA)重编程试剂盒诱导而成；[001引步骤（1)所述的细胞消化液优选激emPK)^Aeeatas#细胞消化液； 步骤（1)中的分种密度，优选每个培养孔接种2. 5X105-3. 0X105个细胞； 所述的ROCK抑制剂优选ROCK抑制剂Y27632;[001引步骤（3)所述的神经元诱导培养基的组成与配比如下： 1X的Knockout?DMEM/F-12 培养基 97血； 2mM的GlutaMAXTM-I添加剂ImL; 20ng/mL的bFGF20μL; 20ng/mL的EGF20μL;2 % 的SiemPro'"'化ural添加剂 2血； 再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为lOOnmol/L。[002引步骤（3)所述的神经元细胞分化培养基的组成与配比如下： 1X的Neuroba就1聘抬养基97血；[002引 2%的B-27?无血清添加剂2血； 2mM的GlutaMAXTM-I添加剂ImL; 再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为lOnmol/L。 自隧存在于ips的诱导分化过程中，体细胞具有较多细胞器，而iPS细胞器较少， 因此由体细胞诱导为iPS的过程中需要自隧参与。自隧是一个吞隧自身细胞质蛋白或细胞 器并使其包被进入囊泡，并与溶酶体融合形成自隧溶酶体，降解其所包裹的内容物的过程， 藉此实现细胞本身的代谢需要和某些细胞器的更新。而iPS分化为神经干细胞及神经元也 具有不同的细胞器及细胞结构，自隧在促进细胞器的转换起作用，因此可加快iPS分化为 神经干细胞及神经元。 本专利技术相对于现有技术具有如下的优点及效果： 1、本专利技术方法可加快神经元的诱导分化形成。在正常的iPS细胞向神经元分化过 程中，添加了雷帕霉素促进自隧后可W使细胞在14天左右即出现神经元的形态。 2、本专利技术方法改善了脊髓小脑共济失调Ξ型iPS的神经元生长状态。脊髓小脑共 济失调Ξ型（SCA3)iPS分化为神经元后随着培养时间的延长，状态会逐渐变差，加入雷帕 霉素后，神经元的状态比没加雷帕霉素的神经元状态好。【附图说明】[003引图1是分化培养到第14天时培养基中神经元细胞突起的形态图；其中，A-对比例 (X4) ;B-对比例（X10) ;C-实施例（X4) ;D-实施例（X10)。 图2是SCA3病人的诱导多能干细胞在分化培养过程中神经元细胞突起的形态图； 其中，A-未添加雷帕霉素的（X4) ;B-添加雷帕霉素的（X4)。【具体实施方式】 下面结合实施例及附图对本专利技术作进一步详细的描述，但本专利技术的实施方式不限 于此。[00对实施例 -种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，包括W下步骤： (1当前第1页1 2 本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种促进人诱导多能干细胞向神经元诱导分化的方法，其特征在于包括以下步骤：(1)融合度70‑80％的人诱导多能干细胞，加入预热的细胞消化液后37℃孵育5分钟，接着用移液管吹吸若干次，使细胞分散成单个细胞悬液，然后将细胞分种在培养孔中；每孔加入ROCK抑制剂后放入37℃、5％CO2的培养箱中培养；(2)分种后的第一天，吸弃培养孔的上清液以除去未贴壁的细胞，加入预热的神经诱导完全培养基，置于培养箱中继续培养；此后隔天换液，分种后第七天可获得P0代的神经干细胞，继续培养3‑4天获得P1代的神经干细胞；(3)将聚鸟氨酸和层粘连蛋白包被的培养皿置于37℃、5％CO2的培养箱中培养1h，接着在培养皿中添加神经元诱导培养基，再将步骤(2)传代后的P1代的神经干细胞接种到培养皿中，接种密度为2.5×104–5×104个细胞/cm2；神经元诱导培养基中要添加雷帕霉素以促进自噬的发生；培养2天后，将培养基更换为神经元细胞分化培养基，每3–4天更换一次培养基，培养至12‑15天可诱导分化为神经元细胞；步骤(3)所述的神经元诱导培养基的组成与配比如下：1×的KnockOutTM DMEM/F‑12培养基97mL；2mM的GlutaMAXTM‑I添加剂1mL；20ng/mL的bFGF 20μL；20ng/mL的EGF 20μL；2％的Neural添加剂2mL；再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为100nmol/L；步骤(3)所述的神经元细胞分化培养基的组成与配比如下：1×的培养基97mL；2％的无血清添加剂2mL；2mM的GlutaMAXTM‑I添加剂1mL；再往培养基中加入雷帕霉素至终浓度为10nmol/L。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：孙筱放，欧展辉，牛晓华，何文茵，罗敏，陈玉嫦，
申请(专利权)人：广州医科大学附属第三医院，
类型：发明
国别省市：广东;44
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