确定可变区扩增引物是否存在偏向性的方法和装置及其应用制造方法及图纸

本发明专利技术提供了确定可变区扩增引物是否存在偏向性的方法和装置及其应用，所述方法包括：(1)利用通用引物组对含有可变区的核酸样本进行多重PCR扩增，以便获得所述第一扩增产物；(2)对所述第一扩增产物进行第一测序，以便获得所述第一测序结果；(3)利用候选引物组对所述第一扩增产物进行多重PCR扩增，以便获得第二扩增产物；(4)对所述第二扩增产物进行第二测序，以便获得第二测序结果；以及(5)将所述第二测序结果与第一测序结果进行比较，以便确定所述候选引物组是否存在偏向性。利用本发明专利技术的该方法，可以有效地确定不同引物之间扩增的偏向性，且获得的偏向性结果真实可靠。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体地，涉及确定可变区扩增引物是否存在偏向性的 方法和装置及其应用，更具体地，涉及确定可变区扩增引物是否存在偏向性的方法和装置、 扩增可变区的方法和设备、W及测序方法和系统。
技术介绍
B细胞受体度CR)和T细胞受体（TCR)的多样性构成了庞大的免疫组库，保证了机 体可W有效的识别和防御潜在的病原体。适应性免疫系统主要通过克隆性的扩增可W特异 性的识别抗原的T细胞或B细胞来发生作用，所W准确的定量每一种T细胞或B细胞丰度 对了解免疫系统的动态变化是非常重要的。BCR和TCR对抗原的识别主要是通过可变区来 识别的，其中互补决定区3(CDR3)起到尤为重要的作用。[000引从基因水平上来说免疫组库的多样性主要是通过BCR和TCR可变区胚系基因片段 的组合多样性，T、B细胞在发育成熟过程中的V、D、J基因重排连接多样性W及重排过程中 基因末端的变异送几种机制产生的。在高通量测序技术（HT巧出现W前，人们就知道T细 胞及B细胞抗原受体基因具有非常高的多样性，但是无法得知抗原受体基因组的情况。高 通量测序使测定复杂的适应性免疫分子成为可能，并展示了巨大的优势，通过高通量免疫 组库测序技术，我们可W很容易的了解个体的免疫组库多样性情况，获得抗原受体基因组 的信息。该技术分别在T/B细胞受体的V基因和J(或C)基因区设计引物，PCR扩增富集 代表T/B细胞多样性的CDR3区域，然后分析测序得到的数十万条T/B细胞受体序列的多样 性情。 但是由于TCR和BCR可变区编码基因由V基因、D基因、J基因、C基因组成，每一 个基因有多个不同胚系基因，需要设计多对引物同时多CDR3区进行扩增。而多对引物在同 一个反应体系中会相互干扰，并产生假阳性的扩增产物，影响多免疫组库多样性的准确测 定。所W开发一种可W准确的评价多重PCR扩增偏向性及假阳性的方法是非常必要的。 然而，目前关于确定多重PCR扩增偏向性及假阳性的研究仍有待深入。
技术实现思路
本专利技术旨在至少在一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本专利技术的 一个目的在于提出一种有效确定可变区扩增引物是否存在偏向性的方法。 本专利技术是基于专利技术人的下列发现而完成的：[000引成熟T细胞和B细胞抗原受体灯CR和BCR)可变区基因组成如图1所示，由重排 后的V、D、J基因组成，之后是恒定区的C基因。V基因根据功能可W分成FR1、CDR1、FR2、 CDR2、FR3五个区域；整个可变区的长度为50-1000个碱基对化P)，平均长度为400-5(K)bp。 V基因部分区域、D基因（轻链无D基因）、J基因部分区域、随机插入片段（脚组成CDR3区 域，该区域在抗原识别过程中发挥最重要的作用，多样性最高。V基因由20-600个核巧酸 组成，J基因由15-300个核巧酸组成。对于基因组DM样品来说，J基因和C基因之间由 内含子隔开，对于表达的信使RNA样品来说，J基因和C基因的内含子被剪切掉，J基因和C 基因如图1所示连接在一起。 高通量免疫组库测序是在V区和J区设计引物（对于信使RNA来说，也可W在V区 和C区设计引物），多重PCR扩增可变区。V区的最佳引物设计方法是将引物设计在FR1区 域，反向扩增引物设计在J区的FR4区，对于RNA样品，反向引物也可W设计在C基因区。因 为送样可W扩增到整个可变区的DNA序列，同时FR1区的多样性比较低，只需要少量的引物 就可W扩增所有的V基因。但是由于扩增产物较长巧O-lOOObp，平均400-5(K)bp)，需要用读 长较长的测序平台才可W读到所有的核巧酸，如IlluminaMiseq测序平台，Roche454测序 平台。但送些测序平台测序成本都比较高，不适合大量样本测序。目前一般免疫组库测序只 对CDR3区域进行扩增和测序，正向扩增引物设计在V区的FR3区域，反向扩增引物设计在J 区的FR4区，对于RNA样品，反向引物也可W设计在C基因区，扩增产物长度为50-300bp，可 W用通量比较高，成本比较低的Illumin址iseq平台或LifeTechnologies的IonProton 平台测序。而在多重PCR过程中多对引物之间会相互影响，造成扩增的偏差化ias)。 为了解决上述技术问题，在本专利技术的第一方面，本专利技术提供了一种确定可变区扩 增引物是否存在偏向性的方法。根据本专利技术的实施例，该方法包括：（1)利用通用引物组对 含有可变区的核酸样本进行多重PCR扩增，W便获得所述第一扩增产物；（2)对所述第一扩 增产物进行第一测序，W便获得所述第一测序结果，（3)利用候选引物组对所述第一扩增产 物进行多重PCR扩增，W便获得第二扩增产物；(4)对所述第二扩增产物进行第二测序，W 便获得第二测序结果；W及（5)将所述第二测序结果与素所述第一测序结果进行比较，W 便确定所述候选引物组是否存在偏向性，其中，候选引物组包括候选正向引物和候选反向 引物，所述通用引物组包括通用正向引物和通用反向引物，所述通用正向引物的识别位点 在所述候选正向引物的识别位点的上游，所述通用反向引物的识别位点在所述候选反向引 物的识别位点的下游。专利技术人发现，利用本专利技术的该方法，可W有效地确定不同引物之间扩 增的偏向性，且获得的偏向性结果真实可靠。另外，基于得到的偏向性结果，可W调整扩增 引物序列及引物的组合，达到将扩增偏向性降到最低程度的效果。 根据本专利技术的实施例，所述含有可变区的核酸样本为DNA或RNA。 根据本专利技术的实施例，利用读长不低于4(K)bp的测序平台对所述第一扩增产物 进行所述第一测序，所述读长不低于40化P的测序平台为选自IlluminaMiSeq、Illumina MiSeqDx、IonPGM、Roche454和单分子测序平台中的至少一种。由此，能够有效获得可变 区的全长测序结果。 根据本专利技术的实施例，利用读长不低于l(K)bp的测序平台对所述第二扩增产物 进行所述第二测序，所述读长不低于10化P的测序平台为选自Illumina化Seq、Illumina Miseq、IlluminaMiSeqDx、HiseqXteruLifeS0LiD、IonTorrent、IonPGM、IonProton、 Roche454和单分子测序平台中的至少一种。。由此，能够快速有效地获得第二测序结果，且 操作方便，成本低廉。 根据本专利技术的实施例，所述通用正向引物的识别位点和所述候选正向引物的识别 位点在V区，所述通用反向引物的识别位点和所述候选反向引物的识别位点在J区或C区。 由此，利用通用引物组和候选引物组可W有效扩增基因的可变区。 根据本专利技术的实施例，所述通用正向引物的识别位点在FRl区或FR2区，所述候选 正向引物的识别位点在FR3区，所述通用反向引物的识别位点在FR4区或者C区，所述候选 反向引物的识别位点在FR4区或者C区。由此，利用通用引物组可W有效扩增可变区全长， 利用候选引物组可W有效扩增CDR3区。 需要说明的是，本文中所使用的术语"可变区"是指B细胞受体度CR)或T细胞受 体灯CR)中的可变区。 在本专利技术的第二方面，本专利技术提供了一种扩增可变区的方法。根据本专利技术的实施 例，该方法包括：利用前面所述的方法确定候选引物组是否本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定可变区扩增引物是否存在偏向性的方法，其特征在于，包括：(1)利用通用引物组对含有可变区的核酸样本进行多重PCR扩增，以便获得第一扩增产物；(2)对所述第一扩增产物进行第一测序，以便获得第一测序结果；(3)利用候选引物组对所述第一扩增产物进行多重PCR扩增，以便获得第二扩增产物；(4)对所述第二扩增产物进行第二测序，以便获得第二测序结果；以及(5)将所述第二测序结果与所述第一测序结果进行比较，以便确定所述候选引物组是否存在偏向性，其中，所述候选引物组包括候选正向引物和候选反向引物，所述通用引物组包括通用正向引物和通用反向引物，所述通用正向引物的识别位点在所述候选正向引物的识别位点的上游，所述通用反向引物的识别位点在所述候选反向引物的识别位点的下游。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：武靖华，刘晓，曾晓静，杜元平，王长希，张伟，
申请(专利权)人：深圳华大基因科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44