本发明专利技术提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重PCR引物，所述多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示引物对、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对。本发明专利技术提供的多重PCR引物组能用于β-地中海贫血突变多样性的高效检测，可覆盖中国南方人群β-地中海贫血突变的46个点突变位点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分子生物学领域，特别是设及一种基于下一代测序技术检测β-地中 海贫血突变的多重PCR引物和方法及应用。
技术介绍
β-地中海贫血是一种由于β-珠蛋白基因突变导致肤链表达失衡而产生的单基 因遗传血液病，多由β-珠蛋白基因点突变所致。β-地中海贫血是世界上最常见的遗传性 之一，据统计全世界约有1亿多人携带β-地中海贫血基因。β-地中海贫血也是我国南方 各省最常见、危害最大的遗传病之一，我国部分省份的β-地中海贫血携带率见表1。地中 海贫血基因主要为点突变，在中国南方人群中β-地中海贫血基因覆盖了 46种点突变。 表1中国南方β地贫的人群携带率β-地中海贫血的基因诊断方法主要有：Sanger测序法、限制性片段长度多态性 (RFLP)、反向点杂交（畑B)、等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)。Sanger测序方法操作较繁琐， 极大地限制了其在临床诊断中的应用，测序的检测通量也有限，并且对检测结果需要人工 分析，分析耗时耗力。RFLP是通过识别特异性序列位点进行酶切反应，方法简便成本低廉， 但其局限性是只能对有限的可产生酶切位点的突变进行检测，由于不完全或部分酶切反应 还会导致假阳性或假阴性结果。反向点杂交技术的结果是用肉眼判读，失误率高，往往造成 一份样本反复检测。ARMS-PCR需针对每个突变设计相应引物，每一对引物扩增条件都需优 化，若需同时检测多种突变时则操作繁琐，而且也会出现假阳性或假阴性结果。 基于地贫缺陷基因的市场和社会检测需求，W及目前地贫缺陷基因检测现状的落 后，利用高通量测序技术开发地贫基因突变位点检测试剂盒势在必行。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多重 PCR引物和方法及应用。 第一方面，本专利技术提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多 重PCR引物，所述多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQIDΝ0:1和SEQIDΝ0:2 所示引物对、SEQIDNO: 3和沈QIDNO:4所示引物对、SEQIDNO: 5和沈QIDNO:6所示 引物对、569 10^:7和沈9 10^:8所示引物对、569 10^:9和沈910^:10所示引物 对、SEQIDNO: 11和沈QIDNO: 12所示引物对。 优选地，所述SEQIDNO: 1-SEQIDNO: 12中的一条或多条引物替换为各引物自身 3'端延长或截短0~3个碱基后所得的引物。 本领域技术人员可W理解的，若摸索的多重PCR引物组（比如，SEQIDN0:1~SEQ IDN0:12所示6对引物组成的引物组）获得了较佳的扩增效果，一般情况下，设计引物的时 候，适当的将多重PCR引物组中任一一条引物的长度延长或截短0~3个碱基，也可W获得 不错的多重PCR扩增效果，也应纳入本专利技术保护范围。 第二方面，本专利技术提供了一种基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变的多 重PCR方法，包括如下步骤：[001引取待测样品；[001引采用多重PCR反应扩增待测样品获得多重PCR产物，其中，所述多重PCR反应采用 的多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQIDΝ0:1和SEQIDΝ0:2所示引物对、 沈QIDNO: 3和沈QIDNO:4所示引物对、沈QIDNO: 5和沈QIDNO:6所示引物对、沈Q IDNO:7和沈QIDNO:8所示引物对、沈QIDNO:9和沈QIDNO: 10所示引物对、沈QID NO: 11和沈QIDNO: 12所示引物对。 优选地，所述SEQIDNO: 1-SEQIDNO: 12中的一条或多条引物替换为各引物自身 3'端延长或截短0~3个碱基后所得的引物。 优选地，所述待测样品为DNA样品或RNA样品。 当所述取待测样品为DNA样品时，进行多重PCR的体系参照普通PCR体系进行配 置；当所述取待测样品为RNA样品时，要先进行逆转录合成cDNA，再合成第二链DNA，此时， 逆转录合成cDNA的步骤相当于一个循环的多重PCR(只采用上游引物组或下游引物组），合 成第二链DNA的步骤也相当于一个循环的多重PCR(只采用下游引物组或上游引物组）。 优选地，所述多重PCR反应的体系中，上游引物组中的各上游引物等摩尔混合；下 游引物组中的各下游引物等摩尔混合。[001引如本专利技术所述的上游引物组"或"下游引物组"为如第一方面所述的多重PCR引 物中各引物对的上游引物或下游引物组成的上游引物组或下游引物组；具体地，本专利技术用 "F"表示上游引物，用"R"表示下游引物，如表2所示。 优选地，所述多重PCR反应的体系中，模板量为50ng~lug/50ul体系。 优选地，所述多重PCR反应的程序为： 上述程序具体为：95°(：预变性15111111，95°(：变性153,60°(：退火2111111，72°(：延伸 3min，循环30~40次（优选为35次），最后72°C后延伸lOmin。 优选地，所述多重PCR反应结束后，电泳，割胶回收片段长度为240-27化P的DM 片段。 优选地，将所得多重PCR产物进行建库后进行高通量测序，并通过生物信息学分 析高通量测序结果，分析β-地中海贫血突变。第Ξ方面，本专利技术提供了一种检测β-地中海贫血突变的试剂盒，包括如第一方 面所述的基于下一代测序技术检测β-地中海贫血突变多态性的多重PCR引物。 第四方面，本专利技术提供了一种如第一方面所述的基于下一代测序技术检测β-地 中海贫血突变的多重PCR引物或第二方面所述的基于下一代测序技术检测β-地中海贫血 突变的多重PCR方法在检测β-地中海贫血突变多态性中的应用。 本专利技术提供的基于下一代测序技术检测β -地中海贫血突变的多重PCR引物及方 法的有益效果为：1)覆盖了南方人群46种点突变位点；2)平均扩增产物的长度在250bp左 右，扩增的产物可用于所有的下一代测序平台。【附图说明】[002引图1为本专利技术实施例提供的单独引物PCR的琼脂糖凝胶电泳图；图2为本专利技术实施例提供的多重PCR的琼脂糖凝胶电泳图； 图3为本专利技术实施例提供的测序深度的生物信息学分析结果。【具体实施方式】 材料及试剂说明：β地中海贫血患者：来源于深圳市人民医院，患者知情同意。非特殊说明，本专利技术 实施例采用的试剂均为市售商品，本专利技术实施例采用的数据库均为公开的在线数据库。 具体地，本专利技术引物如下： 表2.多重PCR引物序列 设计引物：采用Oligo7. 0和Μ阳primer-2. 0对引物二聚体W及茎环错配进行分 析，在包含突变位点的外显子两端设计引物，扩增的序列平均长度在250bp左右，且6对引 物的退火溫度基本一致。 本实施例提供的引物组覆盖了南方人群46个点突变位点。由于很小的序列变化 将导致引物扩增效果显著降低，专利技术人分别针对不同目的区域的不同区段设计了多组多重 PCR引物组，在经过预实验筛选后，综合产物片段长度和点突变覆盖范围，本专利技术选取了扩 增效果最佳的引物组，如上表2所示。 表3 :46种见于中国南方人群导致表达降低的β地中海贫血点突变及对应的本发 明的引物 实施例1 本专利技术实施例1提供了一种β-地中海贫血突变待测DM样品的制备方法，包括 如下步骤： 收集的新鲜外周血样本各2毫升（ml本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于下一代测序技术检测β‑地中海贫血突变的多重PCR引物，其特征在于，所述多重PCR引物为如下引物对中的两对或多对：SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示引物对、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示引物对、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示引物对、SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8所示引物对、SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所示引物对、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示引物对。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：葛良进，刘松，李改玲，邓力蔚，林群婷，刘丽春，
申请(专利权)人：深圳市瀚海基因生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44
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