本发明专利技术公开了通过抗体库技术获得的抗胰岛素样生长因子受体(IGF-1R)的人源功能抗体LMAb1。通过分子生物学等技术获得上述抗体后，将其构建至真核表达载体，瞬时转染后获得抗体。利用包括流式细胞术、细胞增殖抑制、细胞迁移、克隆形成、体内抑瘤等对其进行生物学功能检测。体外实验的结果显示，LMAb1能够结合膜IGF-1R，有效杀伤IGF-1R阳性细胞、抑制肿瘤细胞迁移和克隆形成，体内实验结果显示LMAb1能够抑制肿瘤生长，延长小鼠生存时间。本发明专利技术还公开了上述抗体的序列及制备方法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及通过噬菌体库获得的抗IGF-1R人源功能抗体LMAbl。具体而言，通过 分子生物学方法从全人噬菌体抗体库中筛选到了一株抗人IGF-1R人源抗体LMAbl，通过真 核表达系统获得相应的抗体，最后通过生物学实验对抗体的体外、体内功能进行评价。
技术介绍
胰岛素生长因子IGFs及其受体IGF-1R与肿瘤的关系密切。IGF-1R是跨膜受体， 属于受体酪氨酸激酶（RTK)，基因定位于染色体15q25_26,其前体为一条单链多肽，经剪切 加工去除30个氨基酸的信号肽序列后，肽链被糖基化，并断裂成一条具有706个氨基酸的 胞外A亚单位和626个氨基酸构成的穿膜B亚单位。A和B亚单位通过二硫键形成一个AB 半受体，它与另一个AB半受体构成一个完整受体A2B2。其胞外的A亚单位富含半胱氨酸， 决定配体结合的特异性，B亚单位则穿越细胞膜，传导配基诱导的信号，B链的不同区域可 以介导IGF-1R不同的生物学活性，其中Y950 (第950位酪氨酸残基）为Src同源域2 (She) 和IRS-1的结合位点，K1003(第1003位赖氨酸残基）是ATP结合位点，Y1131、Y1135和 Y1136是酪氨酸激酶活性区域，它能够促使IRS-1等底物发生磷酸化，并可以促进细胞集落 的形成，而位于IGF-1R C端的Y1250和Y1251可以使细胞获得转化功能，Y1316则可以和 PI3激酶结合，发挥抗细胞凋亡及促有丝分裂等生物学功能。当配基与IGF-1R结合后可诱 导其自身及IRS、She、Grb 10等底物磷酸化，同时启动细胞内P13K-PKB/AKT和RAS-RAF-MAPK 等信号级联反应，促进细胞有丝分裂，抑制细胞凋亡。因此，IGF-1R不但对正常组织有增殖 效应，而且也是细胞恶性转化的前提，与肿瘤的发生、发展密切相关。 IGF-1R在恶性神经系统肿瘤、恶性黑色素瘤、前列腺癌、乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝 癌等多种恶性肿瘤组织中呈高表达状态，其酪氨酸激酶活性也有所增强。IGF-1R的激活在 细胞增殖方面有以下重要作用：（1)可促进有丝分裂；（2)是某些类型细胞转化表型建立和 维持的前提及肿瘤发生所必备；（3)可减少肿瘤细胞凋亡，由此导致或加速肿瘤形成和进 展。研究表明，IGF-1R在乳腺癌中高表达，且IGF-1R能够介导乳腺癌细胞的有丝分裂；在 子宫内膜腺癌中IGF-1R的表达显著高于正常组织和良性增生内膜，可能的机制为：IGF-1R 通过与配体结合，激活下游分子如MAPK等的相互作用，通过与细胞癌基因如c-myc、c-src 等的协同表达从而促使胞内蛋白发生磷酸化，诱导核内相关癌基因的表达，最终导致细胞 癌变。 总而言之，在大多数肿瘤中IGF-1R表达增加，促进肿瘤细胞的增殖，与恶性肿瘤 的发生、发展、浸润和转移有密切的联系，因此IGF-1R能够作为肿瘤诊断、治疗和预后的重 要参考。IGF-1R是一个极具吸引力的肿瘤靶向治疗的靶点，其拮抗剂如特异性抗体、反义核 酸等能够调节肿瘤细胞表面的IGF-1R的表达，使肿瘤细胞的增殖受到抑制，促进肿瘤细胞 凋亡、影响肿瘤新血管形成从而抑制肿瘤生长，发挥良好的抗肿瘤效应。 本项专利技术利用噬菌体抗体库方法获得了 一株新型抗人IGF-1R人源功能抗体 LMAbl。体外试验显示，LMAbl具有良好的生物学效应，能够特异性识别细胞膜表面的 IGF-1R(图1)，抑制IGF-1R阳性细胞的增殖（图2)、迁移（图3)和克隆形成（图4);体内 试验显示，LMAbl能够抑制移植瘤的生长，降低小鼠的死亡率（图5)。LMAbl为IGF-1R表 达阳性的癌症等相关疾病的预防和治疗提供了选择。
技术实现思路
为了提供新的抗IGF-1R抗体分子，本专利技术公开了一种抗IGF-1R人源抗体LMAbl 可变区氨基酸序列，其特征在于重链可变区氨基酸序列为序列1，轻链可变区氨基酸序列为 序列2。 本专利技术还公开了一种抗IGF-1R人源抗体LMAbl可变区基因序列，重链可变区基因 为序列3,轻链可变区基因为序列4。 本专利技术公开的抗体LMAbl的特征之一是能够识别细胞膜表面靶抗原IGF-1R。 本专利技术公开的抗体LMAbl的特征之一是能够特异性地抑制IGF-1R阳性细胞的增 殖。 本专利技术公开的抗体LMAbl的特征之一是能够特异性地抑制IGF-1R阳性细胞的迁 移。 本专利技术公开的抗体LMAbl的特征之一是能够特异性地抑制IGF-1R阳性细胞的体 外克隆形成。 本专利技术公开的抗体LMAbl的特征之一是能够在动物体内发挥抑制肿瘤增殖的功 能，降低小鼠死亡率。 具体实施过程如下： 1)利用全人源天然抗体库筛选获得抗IGF-1R抗体LMAbl基因序列； 2)设计相应的引物，构建抗IGF-1R抗体LMAbl真核表达载体； 3)抗IGF-1R抗体LMAbl的真核表达及纯化； 4)抗IGF-1R抗体LMAbl体外生物学活性的鉴定，包括抗原结合及抑制细胞增殖、 迁移和克隆形成； 5)抗IGF-1R抗体LMAbl体内抑瘤活性的鉴定。 下面参照上述步骤详细描述抗IGF-1R人源抗体LMAbl的设计及制备过程。设计 及制备本专利技术抗体的方法仅仅是说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的 方法，或者采用修改的方法。 1)利用全人源天然抗体库筛选获得抗IGF-1R抗体LMAbl基因序列。 基于已建立的大容量全人源抗体库，利用细胞筛选方法筛选阳性结合的克隆，并 经测序获得抗IGF-1R人源抗体序列。 2)设计相应的引物，构建抗IGF-1R抗体LMAbl真核表达载体。 根据获得的抗体LMAbl轻重链可变区基因序列，设计相应的突变引物，在重链可 变区基因两端分别引入Pvu II和BstE II位点，轻链可变区基因两端分别引入EcoRV和 Xho I位点，利用PCR技术合成LMAbl轻重链可变区基因；经酶切、链接构建抗IGF-1R抗体 LMAbl真核表达载体，进行序列测定。 3)抗IGF-1R抗体LMAbl的真核表达及纯化； a)抗体LMAbl的表达：大量制备克隆了抗体LMAbl轻重链基因的真核表达质粒， 通过脂质体转染方法瞬时转染真核表达细胞，培养足够长时间候后收获上清，上清中含有 目的抗体。 b)LMAbl的纯化：利用Protein A/G亲和层析法获得纯化抗体LMAbl。 4)抗IGF-1R抗体LMAbl体外生物学活性的鉴定，包括抗原结合及抑制细胞增殖、 迁移和克隆形成。 a)体外LMAbl结合IGF-1R细胞：收集膜IGF-1R阳性的细胞，加入梯度稀释的 LMAbl抗体，冰上孵育0. 5h，洗涤后再加入PE标记的荧光标记的羊抗人二抗，以确定抗体 LMAbl的膜抗原结合能力。 b)细胞增殖抑制试验：收集细胞，重悬计数，调整细胞浓度至2X104/ml，96孔板 中加入细胞，每孔50 μ 1，同时加入梯度稀释的LMAbl抗体50 μ 1，继续37°C培养72h。每孔 加 10 μ 1CCK-8,测 0D450 值。 C)细胞迁移试验：重悬计数，调整细胞浓度至3 X 105/ml，取250 μ 1细胞加入迁移 板上室，板下部加750 μ 1含不同浓度LMAbl抗体的培养基。37°C培养24h，用棉签擦净上室 底部细胞，固定并染色本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗胰岛素样生长因子受体(IGF‑1R)人源抗体，其特征在于该抗体重链可变区氨基酸序列为序列1，轻链可变区氨基酸序列为序列2。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：乔春霞，吕明，冯健男，周婷婷，耿晶，林周，王巍，李新颖，罗龙龙，于鸣，黎燕，沈倍奋，
申请(专利权)人：中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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